MTT原理方法及操作步骤

MTT 原理、步骤、结果分析方法及注意事项MTT 原理MTT 全称为 3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z—y1)—3，5—di— phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3—（4，5-二甲基噻唑-2)—2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT 比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能.二甲基亚砜(DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 490nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济。缺点：由于 MTT 经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法 通常，此法中的 MTT 浓度为 5mg/ml。因此，可以称取 MTT 0。5 克，溶于 100 ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培育基中，用 0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放 4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 需要注意的是，MTT 法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数.在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在 0—0。7 范围内。MTT 一般最好现用现配，过滤后 4ºC 避光保存两周内有效，或配制成 5mg/ml 保存在—20 度长期保存,避开反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把 MTT 粉分装在 EP管里,用的时候现配，直接往培育板中加，没必要一下子配那么多，尤其当 MTT 变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT 有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的 MTT 需要无菌,MTT 对菌很敏感;往 96 孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。配制 MTT 时用 PBS(ph=7。4)溶解。PBS 配方：Nacl 8g ＋ Kcl 0。2g ＋ Na2HPO4 1。44g ＋ KH2PO4 0。24g 调 pH 7.4，定容 1L.普通 MTT 法实验步骤：1：接种细胞:...