血红蛋白的提取与分离【教学目标】1、 通过尝试对 血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。【知识梳理】1、 凝胶色谱法（也称分配色谱法） （1）概念：是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。（2）原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。2、缓冲溶液： （1）作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液 pH 的影响，维持 pH 基本不变。（2）配置：通常由 1～2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同 pH 范围内使用的缓冲液。3、电泳：（1）概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。如多肽、核酸等分子具有可解离的基团，在一定的 pH 下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。（2）原理：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质 的差异 及分子本身的 大小 、形状 的不同 ，使带电分子产生不同的 迁移速度 ，从而实现样品中各种分子的分离。（3）方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。4、蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。5、样品处理：包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液。（1）红细胞的洗涤：① 目的：去除杂蛋白。 ② 为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。③ 所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为 0.9%的 NaCl 溶液）。④ 缓慢搅拌，采用低速短时间离心。 ⑤ 洗涤干净的标准是上清液没有黄色。（2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。试管中的溶液分为 4 层，从上往下依次是：① 无色透明的甲苯层。 ② 白色薄层固体：脂溶性物质 沉淀 层。③ 红色透明液体：血红蛋白 溶液层 。 ④ 暗红色沉淀层：红细胞破碎物 沉淀 。6、粗分离：即透析。（1）方法：取 1mL 血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有 300mL 物质的量浓度...
