293T荧光素酶报告基因试验VIP免费

293T荧光素酶报告基因实验在研究转录因子和启动子的实验中，你是否想确定结合位点的序列？这些问题都可以用双荧光素酶报告基因检测系统来尝试解决。双荧光素酶报告基因检测系统介绍基于荧光素酶（luciferase）的发光原理，科学家发明了双荧光素酶报告基因检测系统。该系统包括萤火虫荧光素酶（Fireflyluciferase）和海肾荧光素酶（Renillaluciferase）。两者可催化各自的底物发生氧化作用产生生物荧光，产生的荧光数值大小即表示了两种酶的表达量多少。Fireflyluciferase和Renillaluciferase之所以被称为报告基因，是因为在基因表达调控研究时，利用两者表达产生的荧光比值可以监控、证实微观层面上的分子间的相互作用。具体做法是：将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Fireflyluciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Fireflyluciferase基因的下游，以研究启动子的强弱和转录因子对启动子的作用或miRNA对目的基因或lncRNA的调控作用（见图2）。与此同时，引入包含Renillaluciferase基因的TK载体作为内参，以便消除细胞转染等因素带来的组间误差。双荧光素酶报告基因检测系统中的luciferase来源于细菌、萤火虫、发光海洋生物等，可以在哺乳细胞中直接表达，无需表达后修饰，直接具备完全酶活性。与绿色荧光蛋白（GFP）不同，它们的发光检测不需要激发光激发，且发光穿透力更强，这使其具备可定量、高灵敏度及低背景等特点。双荧光素酶报告基因检测的应用下面从实验方案设计、实验数据处理及结果分析几个方面介绍几个案例，供大家参考。1、利用双报告基因检测系统研究miRNA与3’UTR的相互作用实验目的：验证大鼠miR-1与靶基因ATG133’UTR是否发生作用，并进一步确定miR-1与ATG133’UTR的作用位点。实验方案：构建luc-3’-UTR-WT载体和luc-3’-UTR-mut载体，将其与海肾载体及miRNAmimics共转染293T细胞，转染24-48h后使用双荧光素酶报告基因检测系统（翊圣产品货号：11402ES）检测。实验分组：aLuc-NC+mimics-NCbLuc-NC+mimics-miR-1cLuc-3’UTR-WT+mimics-NCdLuc-3’UTR-WT+mimics-miR-1eLuc-3’UTR-mut+mimics-NCfLuc-3’UTR-mut+mimics-miR-1实验结果：实验分组Luc值（均值）Ren值（均值）Ratio(均值)Luc-NC+mimics-NC185214320075.798Luc-NC+mimics-miR-1174577300165.854Luc-3’UTR-WT+mimics-NC186580322495.820Luc-3’UTR-WT+mimics-miR-135773302331.202Luc-3’UTR-mut+mimics-NC186556324895.757Luc-3’UTR-mut+mimics-miR-1188393325505.821图3.miR-1与3’UTR相互作用的分析（***表示p<0.001）实验结论：ATG133’UTR为miR-1靶序列。2、利用双报告基因检测系统研究转录因子与启动子的相互作用实验目的：验证转录因子IRF3对IFN-β启动子的调控作用。实验方案：构建Luc-IFN-β启动子载体和IRF3的过表达载体。共转染后，使用双荧光素酶报告基因检测系统（翊圣产品货号：11402ES）检测分析荧光值差异。实验分组：对照组为Luc-IFN-β和pTK-RL，实验组为Luc-IFN-β、pTK-RL和IRF3的过表达载体共转染。实验结果：实验分组Luc值（均值）Ren值（均值）Ratio(均值)对照组695764569790.15实验组4627901624828.48图4.IRF3对IFN-β启动子的调控实验结论：转录因子IRF3对IFN-β启动子起正调控作用。影响双荧光素酶报告基因检测的因素作为报告基因检测试剂研发的厂家，我们为大家总结了获取好数据的方法，避免大家掉坑：坑1：检测数值太低正常表达水平下，荧光值的数量级应在104-107数量级左右，导致数值低主要有以下几个原因：启动子活性、转染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不规范等原因，具体的原因需要实验者进行排查。相应的解决方案如下表：实验问题解决方案转染效率低1、确保细胞状态是良好的，通常选择指数分裂期的细胞进行转染；2、可以选择过表达的荧光蛋白质粒作为阳性对照；3、转染试剂的选择也至关重要，比如在做miRNA研究的实验中，如果Lipo2000或Lipo3000的转染效率不能满足的话，可以选择更换其它转染试剂。裂解不充分1、细胞培养时间不宜过长，最好不超过36h，培养时间过长的话，细胞难裂解2、裂解液的量要足以充分裂解细胞3、实验对象为烟...