核酸提取的原理及方法VIP免费

核酸提取的常见方法及原理核酸提取作为分子实验中最基础的实验之一，几乎是所有实验的基本，无论后续的克隆、PCR、qPCR、建库测序等等都需要核酸才能顺利进行。今天我们就来简单了解核酸提取的基本原理和方法。1、什么是核酸核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）,其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA（rRNA）,信使RNA（mRNA）和转移RNA（tRNA）。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸,其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。2、核酸提取类型1、总RNA提取总RNA中，75-85%为rRNA（主要是28S-26S/23S和18S/16SrRNA），其余的由分子量大小和核苷酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA、miRNA、siRNA、小核RNA（smallnuclearRNA，snRNA）及核仁小分子RNA（smallnuceolarRNA，snoRNA）等组成。2、miRNA提取MicroRNAs（miRNAs）是小型的、高度保守的RNA分子，如小干扰RNAs（siRNAs），通过与他们的碱基配对调节其同源mRNA的分子表达，以预防通过各种机制的表达。他们已成为进行发育、细胞增殖、分化和细胞周期的重点监管机构。3、基因组DNA提取进行基因结构和功能研究以及基因诊断，通常要求得到的片段长度不小于100〜200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。4、质粒抽提质粒抽提方法即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。3、核酸提取纯化原则和要求1、保证核酸一级结构的完整性；2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）；3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。提取方法（常规）：1、总RNA提取总RNA提取试剂盒三氯甲烷1瓶异丙醇1瓶无水乙醇1瓶无RNA酶枪头（1mL、200uL、10uL）各两盒、各一包无RNA酶1.5mL离心管1包DEPC水1瓶TransScript®One-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix（1.2.4灵芝细胞RNA的提取1、将细胞放入预冷的研钵中，加入液氮，研磨成细粉。取100mg细粉至1.5mL离心管，加入1mLTrigol并混匀，室温放置5-10min,使细胞充分裂解。2、12000rpm离心5min，弃沉淀。加入200yL氯仿，振荡混匀30sec，室温放置15min。3、12000rpm/min、4□条件下离心15min。4、吸取上层水相，移至另一新离心管中。5、加入上清量的0.7~1倍体积的异丙醇，室温放置10~30min。6、12000rpm/min，4□条件下离心10min，弃上清，RNA沉于管底。7、加入1mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。8、12000rpm/min，4□条件下离心5min，尽量弃上清，将离心管置室温晾干或真空干燥5-10min，最后用适量ddH2O溶解RNA样品，放置5min，-80□保存。1.2.5cDNA的合成按以下成分在冰上配制反应混合液，混匀后再分装到每个反应管中。置于42口，孵育15min，然后85□加热5sec。合成的cDNA置于-20□保存。20yL反应体系：ToltalRNA50ng~5ygAnchoredOligo(dT)18Primer1yL2xTSReactionMix10yLTransScript®RT/RIEnzymeMix1yLgDNARemover1yLRNaseFreedH2Oto20yL2、miRNA提取材料和方法：转速可以达到13，000rpm的传统台式离心机乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵RNAmisimicroRNA快速提取试剂盒1个方法/步骤1第一次使用前请先在70%乙醇、WashSolution1瓶和WashSolution2/3瓶中加入指定量乙醇！组织培养细胞试剂盒来源：昊鑫生物a.收集＜107悬浮细胞到一个1.5ml离心管。（对于贴壁细胞，孔板培养和细胞瓶培养可以直接裂解，尽可能吸干净所有培养液残留后直接加入1ml的Lysis/Bindingbuffer,迅速轻摇使Lysis/Bindingbuffer充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶，轻轻用移液枪反复吹打混匀接操作步骤项下3。）b.13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，...