基因工程和PCR技术参考人教版VIP免费

欢迎来到徐州师范大学生命科学学院李宗芸普通高中生物课程标准基因工程的基本操作程序PCR技术李宗芸基因工程的基本操作程序1.分：分离目的基因2.切：对目的基因和载体适当切割3.接：目的基因与载体连接4.转：重组DNA转入受体菌5.筛：筛选出含有重组体的受菌体基因工程的操作过程切接转增检ADNA的体外重组（切与接）基因工程的操作过程切----II型限制性核酸内切酶酶解反应接------把载体和目的基因连接成重组体限制性核酸内切酶II型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100lTT37℃1-1.5hr1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1g标准DNA所需的酶量接——把载体和目的基因连接成重组体1.粘端连接2.平端连接3.尾接法•同种内切酶生产的粘性末端的连接•同尾酶生产的粘性末端的连接•不同粘性末端的连接•粘性末端的更换•人工粘性末端的连接同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接BamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'退火退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT5'TGATCAACTAGT5'BclIGCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT不同粘性末端的连接BamHIBamHI5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'CTGCAGGACGTC5'PstIPstI3'T4-DNApolT4-DNApol切平切平5'CG5'GCKlenowKlenow补平补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGGCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC人工粘性末端的连接5‘突出末端5'GCCTAGGATCCG5'5'GCTTAA5'5'5'AATTCGT4-DNAligaseT4-DNAligase5'5'KlenowKlenow补平补平KlenowKlenow补平补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG5'GAATTCTTAA5'5'5'AATTCTTAAGTdTTdTTdTTdTdGTPdGTPdCTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTTAAGGGATCCCCCCCCCTAGGATCCCCCCCCCTAGGGAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG5'5'GAATTGGGGGGGATCCCTTAACCCCCCCTAGGGGATCCCCCCCAATTCCCTAGGGGGGGTTAAG退火退火BamHIBamHIBamHIBamHIEcoRIEcoRIBamHIBamHI人工粘性末端的连接3‘突出末端CTGCA3'GG3'ACGTC5'GCATG3'C5'C3'GTACGT4-DNAligaseT4-DNAligaseTdTTdTTdTTdTdCTPdCTPdGTPdGTPGCATGCCCCCC3'C退火退火PstIPstIPstIPstIC3'CCCCCCGTACGCTGCAGGGGGG3'GG3'GGGGGGACGTC5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCGCGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCGCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACG5'5'GCATGCCCCCCTGCAGCGTACGGGGGGACGTCCTGCAGGGGGGCATGCGACGTCCCCCCGTACGKlenowKlenowPstIPstISphISphI人工粘性末端的连接平头末端C3'GG5'G3'C5'C3'GT4-DNAligaseT4-DNAligaseTdTTdTTdTTdTdTTPdTTPdATPdATPGTTTTTTTTTT3'C退火退火C3'TTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAA3'GG3'AAAAAAAAAAC5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTGS1S1C3'5'5'GTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAACCAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTG加热加热GTCATTTTTTTTTGAAAAAAAAACCAGTAAAAAAAAACTTTTTTTTTGTGACCAGT粘性末端的更换BamHIBamHI5'5'GGATCCCCTAGGT4-DNAligaseT4-DNAligaseKlenowKlenow补平补平GATCC5'G5'GCCTAG5'5'5'GGATCCCTAG5'GATCCCTAGG5'5'GGATCGGAATTCCGATCCCCTAGCCTTAAGGCTAGG5'5'EcoRIEcoRIGGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker同聚物加尾法同聚物加尾法重组率重组率的定义重组率的定义重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。重组率=含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为25-75%重...