Western blot详解及问题分析VIP免费

蛋白质免疫印迹技术及蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析常见问题分析张绍进WesternBlotWesternBlotWesternBlot简介简介WesternBlotWesternBlot一般流程一般流程WesternBlotWesternBlot常见问题分析常见问题分析WesternBlotWesternBlot简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlotWesternBlotWesternBlot基本原理基本原理WesternBlotWesternBlotWesternBlot优点优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlotWesternBlotWesternBlot应用应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlotWesternBlotWesternBlot流程流程蛋白样品的制备•SDS-PAGE•转膜•封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色WesternBlot通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取蛋白样品的提取WesternBlot蛋白样品的定量蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：目前常用比色法测定样品蛋白的含量：BradfordBradford法（考马斯亮蓝法）、法（考马斯亮蓝法）、LowryLowry法（法（Folin-Folin-酚试剂酚试剂法）、法）、BCABCA法等。但各有优缺点，大家可以根法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。说明操作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白质浓度测定的各种方法汇总：http://bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.htmlhttp://bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.htmlWesternBlot蛋白样品的变性蛋白样品的变性2×SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml①100mMTris-HCl(pH6.8)②200mMDTT③4%SDS④0.2%溴酚兰⑤20%甘油⑥ddH2OWesternBlotSDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。WesternBlot蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比WesternBlot不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳WesternBlotSDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDSSDS是一种很强的阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键断开分子内和分子间的氢键，破...