DNA甲基化及其检测6.5VIP免费

武汉大学中南医院基因诊断中心郑芳表观遗传学DNA甲基化DNA甲基化检测方法研究进展一、表观遗传学基因型相同现象1：一个生物体的不同组织基因表达模式截然不同表达模式迥异现象3：肿瘤抑制基因被过量地甲基化而导致失去活性，而基因的DNA序列并不发生变化。现象4：橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳，叶徒相似，其实味不同。同一种水果，在不同产地生长，其味道，大小，外观可能相差很远。Basketballplayer？Singer？President？TVhost？如果他们出生在不同的地方…基因环境表型相同的基因型不同的表型?什么是表观遗传学？表观遗传学：基因序列无变化基因功能发生变化可遗传并且是可逆的表观遗传学机制：DNA甲基化组蛋白修饰RNA调控（RNA干扰，microRNA,longnon-codingRNA等)基因型不变的情况下，影响表型并能遗传的现象，称为表观遗传或后生遗传。表观遗传学研究的是在基因组DNA序列不变的情况下，在表型上具有的稳定的、可遗传(或潜在的可遗传性)的变化。定义定义‘‘Epi’Epi’geneticsgenetics-‘On’or‘over’thegeneticinformationencodedinthe-‘On’or‘over’thegeneticinformationencodedintheDNADNA在细胞基因组上存在两类信息：在细胞基因组上存在两类信息：A-A-遗传学信息遗传学信息B-B-表观遗传学信息表观遗传学信息前者前者————维持细胞活性功能工厂的所有物质材料维持细胞活性功能工厂的所有物质材料后者后者————怎么建、何时建、在哪建的附加信息怎么建、何时建、在哪建的附加信息基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以基因组不仅仅是序列包含遗传信息，而且其修饰也可以记载遗传信息。记载遗传信息。DNAsequencecodingEpigeneticprogramming表观遗传的特点：表观遗传的特点：广泛，多样，复杂DNA甲基化染色质重塑RNA调控（RNA干扰，非编码RNA:microRNA,longnon-codingRNA等)表观遗传学目前的主要研究发现二、DNA甲基化DNA甲基化组蛋白翻译后修饰RNA机制1950年，Wyatt在Nature上首次指出测序结果表明DNA可能存在第5碱基。DNA甲基转移酶：DNMT胞嘧啶：Cytosine5’-甲基胞嘧啶：5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸：SAMS-腺苷-高半胱氨酸：SAH1）广泛性2）可遗传性3）可逆性4）组织特异性CpG岛(CpGislands)在结构基因5’端附近的调控区段，CG二联核苷常常以成簇串联的形式排列，含量大于50%。预测软件http://pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.htmlhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/广泛性广泛性A:未甲基化或低度甲基化的启动子能够允许转录正常进行。B:甲基化的CpGs阻止转录因子的结合，因此阻止转录。C:MBP(Me-CpGbindingprotein)也阻止转录因子和启动子区的结合。其他，如改变染色质结构，…DNA修复基因表达的调节癌基因代谢凋亡分化细胞周期DNA甲基化DNA甲基化的功能三、DNA甲基化检测手段DNA甲基化检测方法总览主要检测途径•3-1基于重亚硫酸盐转化的方法•3-2不基于重亚硫酸盐转化的方法3-1基于重亚硫酸盐转化的方法质谱分析•水解核苷酸•质谱分析图6PMVK基因扩增产物反向测序结果图7TRIB3基因扩增产物正向测序结果应用二：重亚硫酸盐转化后PCR克隆测序(Bisulfite-sequencePCR，BSP)注：A：癌组织；B：癌旁组织；○：未甲基化；●：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43BBSP克隆测序结果BSP克隆测序结果BSP克隆测序甲基化率三维图形BSP克隆测序甲基化率三维图形应用三：甲基化特异性PCR(methylafion-specificPCR，MS-PCR)甲基化特异性PCRUMUMUMladder100150200250MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化图MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。MSP扩增产物凝胶电泳图研究结果研究结果注：M表示甲基化，U表示未甲基化B1-B6为高脂血症组六例标本，D1-D5为正常对照组五例标本；H2O为阴性对照；m为50bpMarker。SREBP-1基因启动子区CpG岛甲基化状态优点：①操作简便；②敏感性高。缺点：①引物设计要求高；②只能作定性研究；③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性；④只能了解部分位点的甲基化状态。应用四：结合重亚硫酸盐的限...