、蛋白浓度的直接测定(UV法)这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。(1)简易经验公式蛋白质浓度(mg/ml)=[1.45*0D280-0.74*0D260]*Dilutionfactor(2)精确计算通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果：蛋白质浓度(mg/ml)=F*(1/d)*OD280*D其中d为测定0D值比色杯的厚度D为溶液的稀释倍数二．紫外吸收法测定蛋白质含量【实验目的】1.学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。2.掌握紫外分光光度计的操作方法。【实验原理】大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸(酪氨酸和色氨酸)残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收,并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。【实验材料】1.实验器材试管及试管架；50毫升容量瓶2只；移液管；紫外分光光度计。2.实验试剂(1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg/ml的酪蛋白溶液。(2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。实验操作】1.绘制标准曲线取7支试管按下列各表加入各试剂管号试剂0123456标准蛋白质溶液(ml)0.00.51.01.52.02.53.0蒸馏水(ml)8.07.57.06.56.05.55.0蛋白质浓度0.000.120.250.370.500.620.7(mg/ml)05050550试剂加完后摇匀，在紫外分光光度计上，于280nm处以0号管为对照，分别测定各管溶液的光密度值。以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘制出标准曲线。2.测定未知样品取样品溶液4毫升，加蒸馏水4ml混匀，在280nm下测定其光密度值。【实验结果】根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。二、比色法蛋白浓度测定蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸(如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。三•双缩脲法(Biuret法)实验原理双缩脲(NH3C0NHC0NH3)是两个分子脲经180°C左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuS04形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。9L'BPn!试剂与器材试剂：'T!'$d3V,J%A(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10mg/mI的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/mI的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05NNaOH配制。1J八+}:~1L2~N"?6C(2)双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜(CuS04・5H20)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H406・4H20),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。器材：)m,W4G%C9~,w)O1.可见光分光光度计)qA4S8X9t,n2.比色杯3.大试管15支4.旋涡混合器等。操作方法2G0?3_+八-h)FV1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温(20~25°C)下放置3...
