人心肌肌钙蛋白I胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用VIP免费

北京协和医学院(中国医学科学院)硕士学位论文人心肌肌钙蛋白I胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用姓名：郝建秀申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张春明；赵启仁；王德芝201105中困医学科学院北京协和医学院硕I：研究生毕业论文中文摘要人心肌肌钙蛋白I(humaIlcardiactroponinI，hcTnI)是检测心肌损伤的重要标志物。目前，临床检测cTnI的方法很多，但由于不同的cTnI片段清除率和降解速度不同、所用抗体针对的抗原表位和抗体亲和力不同、以及标准品不同等因素的影响，使检测结果间存在很大差异。据研究报道，不同方法之间检测结果的差异可达100倍，因此，开展cTnI检测方法的标准化研究是十分必要的。目前，我国尚无自主研制的cTnI诊断试剂盒，临床使用的均为国外进口或国外原料国内组装试剂盒，这样既增加了检测成本，也加重了患者的经济负担，从而限制了这一灵敏度高、特异性强的生化标志物在临床上的广泛应用。本研究以重组hcTnI为抗原筛选出的阳性杂交瘤细胞株为基础，研制出高效价、高特异性的单克隆抗体，成功建立了hcTnI胶体金免疫层析检测方法，对其灵敏度、特异性、稳定性、准确性等进行奥了检测，并初步应用于临床。单克隆抗体的大量制备采用动物体内诱生腹水法，通过J下辛酸．饱和硫酸铵沉淀法进行初步纯化，然后经ProteinASpharoseCL_4B亲和层析柱进一步纯化，获得了高纯度的单克隆抗体；以重组hcTnl为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体，采用正辛酸一饱和硫酸铵沉淀法纯化抗血清并鉴定抗体性质，研制出了兔源抗hcTnI多克隆抗体。制备胶体金的方法很多，但其主要原理均为氯金酸在还原剂作用下可以聚合成特定大小的金颗粒。本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金；通过免疫层析技术制备快速检测cTnI的胶体金免疫层析检测试纸条，其主要步骤为：以鼠源抗CTnI单克隆抗体进行胶体金标记作为标记抗体，与样本中的hcTnI结合。以兔源抗cTnI多克隆抗体固定于硝酸纤维素膜上作为捕获抗体，通过捕获与胶体金标记抗体结合的cTnI作为检测线。羊抗鼠19G通过与胶体金标记抗体结合作为质控线；另外本研究研制成的胶体金免疫层析试纸条还与ALFASci肌tificdesi龋sINC的胶体金试剂盒做了检测对比。．经过条件优化，本研究成功获得了cTnI胶体金免疫层析试纸条。该试纸条的检测范围为5ng／m1～lpg／ml；灵敏度为5n咖1；特异性：与肌红蛋白(my0西obin，Mb)、肌酸磷酸激酶同工酶(creatinekinaSe-MB，CK-MB)、CTnT和cTnC均无交叉反应：与进口胶体金试纸条检测结果比较：阳性符合率为96．4％；阴性符合率为100％。综上所述，本研究成功建立了cTnI胶体金免疫层析检测方法，该方法具有灵敏度高，特异性强，简单快捷等优点，适于急性心肌梗死(Acutemyocardialin台action，j蝴I)的早期诊断及科研工作需要。关键词：心肌肌钙蛋白I；胶体金；免疫层析技术：检测2中国仄学科学院北京协和医学院颂I：研究生毕业论文AbstractH啪aIlcardiactroponinI(cTnI)wasanimportantbioch锄iCalmarkerformyocardialinjulyHoweVer，untilrecently，medetectionofcardiac仃oponinIhadv枷ouslimitationsbecausemedifI研enCeoftheclear觚ceratea11dthede伊adationrateofcTnIp印tides，thea11tibodyagainstthedi脓eIlt锄tigenic印itope，theV撕ousa佑nityof锄tibody，usingdiVerseref酹encestalldardsandsoon．Accordingtoresearch，cTnIresultsVaried1OO—fold锄ongdi岱玎eIltassays．1tw嬲necessar)，tostandardizethedTnIproteinallddifhellceassaySofcTnImeasur锄entinclinical．OntheotherhaIld，chinadoesnotindepeIldentlyhaVeacTnIdia缈ostickit．TlleclinicalcTnIdia印ostickitsare舶mabroad0rdomesticasseITlblybyimportodrawmat甜als．111misway'itnotonlyincreaSingtheteStcostbutalsoincreasingmeeconomicburdellofpatients．ThosefactorSarelimitingc，rnI，memoresellsitivityandmorcspcci6cityofbiochemicalmal【％appliedintllecliIlical．Anti·CTnIhybridomacelllin鼯were0btainedbyreC0mbinanthllm锄fhll-leIl啦cTnIas觚tigell．Tllepu唧seofthisresearchwastoobtaintheSu...