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DOI:10.3724/SP.J.1096.2012.11448牛磺酸对大乳鼠心肌细胞抗氧化作用的荧光免疫化学分析张星光1依桂艳2吕肖锋*1刘汉菊3许秀萍1焦秀敏1(北京军区总医院内分泌科1,心血管内科2,北京100700)3(吉化集团公司总医院磁共振科,吉林132000)摘要应用免疫和化学分析方法探讨牛磺酸(Taurine,Tau)对原代培养的新生大乳鼠心肌细胞的保护作用,为心血管疾病的治疗提供理论依据。将原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为对照组、过氧化氢(H2O2)损伤模型组以及H2O2损伤加药物治疗组。预先12h给予Tau治疗药物后,使用H2O2损伤心肌细胞4h,在倒置显微镜观察Tau对心肌细胞形态学的影响,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-Dimethylthiahi-azo(-z-yl)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT)化学分析法测定心肌细胞的存活率,化学试剂盒检测心肌细胞内超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的变化,利用荧光探针DCFH-DA分析检测心肌细胞中活性氧的水平。结果表明,H2O2损伤心肌细胞4h后,Tau可使吸光度升高,并增加心肌细胞SOD活性、降低MDA含量及活性氧水平下降。由此可见,采用荧光免疫分析方法可证实Tau能减轻自由基对心肌细胞的损伤,从而达到保护心脏的作用。关键词牛磺酸;心肌细胞;超氧化物歧化酶;丙二醛;过氧化氢2011-12-23收稿;2012-02-29接受*E-mail:nfmk@126.com1引言心血管疾病是危害人类健康的严重疾病,是造成死亡的主要原因之一。在我国,心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手,并且每年还有数以万计的人因患该病导致残疾,防止心血管疾病发生发展及降低其致死致残率已是非常严峻的问题。心血管疾病的防治已成为我国21世纪提高人民健康水平的重中之重。各种心脏病,如缺血性心脏病、心肌炎、心肌病、慢性充血性心力衰竭等疾病引起心功能下降,心肌组织变化主要是心肌细胞(Myocardialcell,MC)数量减少或功能降低,由此导致心脏顺应性降低,心脏舒缩功能障碍,以上改变最终均会导致心功能衰竭、心律失常、心脏猝死的发生。所以,开发能保护心肌细胞的药物具有重要的现实意义。研究表明,牛磺酸对病毒性心肌炎、心肌缺血的疾病具有治疗作用[1,2],但从细胞水平研究牛磺酸对氧化应激造成的心肌细胞损伤的报道较少[3]。本研究应用荧光免疫分析方法,分析Tau对体外培养的MC的影响,初步探讨其对心脏的保护作用及机制,为防治心血管疾病提供思路及理论基础。2实验部分2.1仪器、试剂及动物半自动生化测定仪(澳大利亚Sunrise公司);荧光共聚焦显微镜和CKX41倒置显微镜(日本Olym-pus公司);UV-5300紫外分光光度计(上海元析仪器有限公司);9602A酶标仪(北京艾普生物设备有限公司);CO2培养箱HERAEUS(中国苏净集团安泰公司)。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成试剂公司);活性氧检测试剂盒(Reactiveoxygenspeciesassaykit,碧云天生物技术研究所);Tau(中国医药集团上海化学试剂公司,批号20061109);Iscove'sModifiedDulbecco'sMedium(IMDM)培养基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);胰蛋白酶(Dfico公司);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT,Sigma公司);Wistar乳鼠(清洁级,由北京大学动物部提供)。第40卷2012年6月分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报ChineseJournalofAnalyticalChemistry第6期955~9592.2实验过程2.2.1心肌细胞原代培养出生1~3d的Wistar乳鼠,无菌取出心脏后用凉磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗心腔内残余血液,剪碎心脏组织,用0.045%胰蛋白酶在37℃水浴分次消化,收集上清液,并用小牛血清终止消化,以1000r/min离心10min,将离心后所得细胞用含10%小牛血清的IMDM悬浮,接种于大小适宜的培养瓶中,贴壁90min后,轻轻振摇吸出尚未贴壁的细胞,即MC。将纯化后MC悬液(5×105/mL)分别接种于96孔板,每孔200mL;24孔板,每孔1mL。培养48h后,更换无血清IMDM继续培养12h,分组进行实验。2.2.2实验分组和给药将无血清培养后的MC随机分为对照组、H2O2损伤组及Tau大剂量(120mmol/L)+H2O2组、Tau中剂量(60mmol/L)+H2O2组、Tau小剂量(30mmol/L)+H2O2组,每组设8个复孔,对照组和模型组采用无血清IMDM。各给药组先用含药无血清IMDM预先与MC共孵育12h,再用终浓度为300mmol/LH2...