BCA法定量蛋白质浓度BCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。操作简便,快速,灵敏度高,准确,试剂稳定性好,经济实用,抗干扰能力强【原理】:碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。【原理】:基本原理BCA(bicinchoninicacid)法蛋白浓度定量:在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+(biuretreaction)。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。【试剂】1、试剂A:分别称取10gBCA二钠盐、20g无水碳酸钠、0.16g酒石酸钠、4g氢氧化钠、9.5g碳酸氢钠,混合调PH值至11.25,加水至1L。2、试剂B:4%硫酸铜。3、BCA工作液:试剂A100ml+试剂B2ml混合。操作步骤1.先将solutionA摇晃混匀,根据样品数量,按50体积solutionA加1体积solutionB试剂(50:1)配制成BCA工作液,充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。2、蛋白质标准液:用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定)3.绘制标准曲线:取6支试管,编号后分别加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL标准蛋白质溶液(BSA),然后各管分别用去离子水补充到0.1mL,最后各试管中分别加入2.0mLBCA工作液,每加完一管,立即在漩涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除),以蛋白质的蛋白含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线的绘制:取试管七支、编号,按下表操作:标准曲线的绘制:取试管七支、编号,按下表操作:4.样品测定:同绘制标准曲线方法,在一支试管中加入待测样品0.1mL代替标准蛋白质溶液,然后加入2.0mLBCA工作液后,立即在漩涡混合器上混合,测吸光度A,查标准曲线,求出待测样品中蛋白质浓度(g/L)。【优缺点】(一)操作简单,快速,45分钟内完成测定,比经典的Lowary法快4倍且更加方便;(二)准确灵敏,试剂稳定性好,BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml,微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。(三)经济实用,除试管外,测定可在微板孔中就进行,大大节约样品和试剂用量;(四)抗试剂干扰能力比较强,如去垢剂,尿素等均无影响此法测定蛋白质浓度,近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCAProteinAssayKit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成,实现了蛋白浓度测定的简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25微克/毫升,最小检测蛋白量达到0.5微克,待测样品体积为1~20微升。试剂盒组成2.稀释标准品:完全溶解蛋白质标准品(5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20℃保存)取10微升用PBS(pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释),使终浓度为0.5mg/ml。将稀释后的标准品(0.5mg/ml)按0,2,4,6,8,12,16,20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中,加标准品稀释液补足到20微升。体积(ul)02468121620终浓度(ug/ul)00.050.10.150.20.30.40.5pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)的配制pH7.4的等渗磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4,PBS):NaCI8.0gKH2PO40.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKCI0.2g将上列试剂按次序加入定量容器中,加适量蒸馏水溶解后,再定容至1000mL,调pH值至7.4,高压消毒灭菌112Kpa20min,冷却后,保存于4℃冰箱中备用。6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,摘自司徒镇强的《细胞培养》实验步骤孔号试剂(mL)空白孔12345测定孔标准蛋白溶液(1.5mg/ml)00.020.040.060.080.1—PBS缓冲液0.10.080.060.040.020-待测样品——————0.1BCA工作液2.02.02.02.02.02.02.0蛋白质含量(μg)0.050.10.20.40.5实验步骤孔号试剂(mL)空白孔12345测定孔标准蛋白溶液(1.5mg/ml)00.020.040.060.080.1—PBS缓冲液0.10.080.060.040.020-待测样品——...