细胞破碎蛋白质复性和固液分离VIP免费

第二篇目标产品的分离与纯化第五章细胞破碎、蛋白质复性和固液分离细胞破碎固液分离初级分离(粗)纯化精制下游技术基本过程下游加工技术的重要性1.产品分离纯化是最终获得商业产品的环节。2.投资费用高（抗生素、乙醇、柠檬酸占60%）。3.分离纯化技术落后会阻碍发酵工程技术的发展。几种产品在发酵液中的浓度产品典型浓度（g/L）抗生素25氨基酸100酒精100有机酸100酶20蛋白质10下游加工技术的特点1.发酵液的复杂性造成分离上的困难性。2.欲提取的产物通常浓度低且很不稳定。3.多为分批操作，各批发酵液不尽相同，要求下游加工有一定弹性。•产物提纯过程的不同决定于：对象材料、目标产物特性及对其纯度的要求第一节概述基因工程生物制品分离纯化:工程菌经过大规模培养后，产生的有效成分含量很低，杂质含量却很高分离纯化极其重要基因工程药物从转化细胞、生产，对产品的纯度要求高于传统产品。发酵液细胞分离胞内产物胞外产物细胞破碎固液分离包涵体细胞碎片分离变性复性浓缩初步分离高度纯化制剂产品基因工程制品分离纯化的一般流程•初级分离：分离细胞和培养液，破碎细胞释放产物，溶解包含体（包涵体），复原蛋白质，浓缩产物，去除大部分杂质等过程。主要决定产物的得率。•纯化精制：初级分离基础上，用各种高选择性手段，主要是各种层析技术，将目标产物和干扰杂质尽可能分开，使产物的纯度达到有关要求。主要决定产物的纯度。产物提纯过程包括两个基本阶段：第二节细胞破碎•目的：释放细胞内含物。•分类：按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法。问题：破碎率是否越高越好？以大肠杆菌为宿主药物多为胞内产物细胞破碎方法分类图1、高压匀浆法•组成：高压泵和匀浆阀•作用机理：高压泵将电机的旋转运动转变成匀浆阀柱杆的直线运动，从高压室（几十兆帕）压出细胞悬浮液，经过碰撞环的撞击后改变方向从出口管喷出，使细胞经历较高的流速下的剪切碰撞发生较大的变形，从而达到破碎细胞的目的。高压匀浆阀结构示意图进液口出液口阀座碰撞环阀杆高压匀浆器19.6-25.4MPa适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎高压匀浆法动力学方程•破碎效率与匀浆阀结构、操作压力和破碎次数有关：Ln(Rm/(Rm-R))=KNPaR：单位生物量释放出的产物量（mg/G)Rm：R的最大值；K：破碎速率常数；N：破碎次数；P：操作压力；a:与微生物性质有关的指数系数。•破碎率---操作压力----温度控制----能耗温度对活性物质的失活作用提高压力需增加能耗：3.5KW/100MPa移走热量需付出代价：23.8℃/100MPa高压匀浆一般需多级操作，每次循环前往往进行级间冷却匀浆过程中产生的热→蛋白质和酶的失活温控和能耗•堵塞（不适合团块状或丝状真菌），质地坚硬者如包含体易损伤匀浆阀，也不适用•温度高易失活，能耗大。存在的问题2、高速珠磨法•原理：细胞和极细的研磨剂在搅拌桨作用下充分混合，珠子之间及珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放内含物。几种常见珠磨器动力学方程•间歇操作:Ln(Rm/(Rm-R))=Ln(D)=Kt其中，D=(1+K1/j)j•连续操作：Ln(Rm/(Rm-R))=KV/f=K`上式中，t是破碎时间；K、K1、K`是破碎速度常数；V是破碎室内悬浮液的体积；f是进料速度；是平均停留时间；j是破碎时全混釜的数目，反映破碎室内悬浮液的流动状况。•采用夹套冷却的方式实现温控,效果较好;•能耗与细胞破碎率成正比;问题：高压匀浆比珠磨法破碎细胞的效果好？温控和能耗高压匀浆法与高速珠磨法的比较项目高压匀浆法高速珠磨法操作参数少多，液体损耗大连续操作时配备热换器进行级间冷却兼具破碎和冷却，减少产物失活达到较高破碎率需循环2-4次一次操作适用范围团状、丝状真菌、较小革兰阳性菌不宜，包含体不宜几乎所有的微生物细胞，包括含有包含体的基因工程菌的破壁X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。3、超声破碎•机理：声频高于15～20kHz的超声波在高强度声能输入时可以进行细胞破碎...