从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较VIP免费

中国农学通报2011,27(7):227-230ChineseAgriculturalScienceBulletin0引言随着生命科学的飞速发展，对生命奥秘的探索已经深入到分子水平。从凝胶中回收DNA是分子生物学实验中经常遇到的问题，特别是对100bp以下的小片段的电泳回收更是分子生物学的重要内容。小片段DNA的回收一般采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)[1]。研究表明，从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度较高，可适用于分子生物学中较高要求的实验[2-4]。虽然目前有几种常用的回收方法[5-7]，也有几家知名生物试剂公司开发了相应的试剂盒，但这些回收方法不是操作较繁琐就是回收成本较高。因此，探索一种操作相对简单、回收效率较高、回收成本较低的基金项目：国家自然科学基金“茶氨酸生物合成的基因转录调控研究”（3087157）；湖南农业大学人才稳定基金“茶树重要功能基因的克隆与鉴定”（07WD22）。第一作者简介：章蕾，女，1986年出生，湖南浏阳，硕士在读。通讯地址：410128湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室，E-mail：zhanglei8665@163.com。通讯作者：刘仲华，男，1965年出生，湖南衡阳，教授，博士生导师，茶叶科学和药用植物资源功能成分研究。通信地址：410128湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室，E-mail：larkin-liu@163.com。收稿日期：2011-01-05，修回日期：2011-03-17。从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较章蕾，袁玲，黄建安，吴文亮，陈东生，刘仲华（湖南农业大学茶学教育部重点实验室/国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙410128）摘要：从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段是分子生物学中的常用技术，尤其针对于DNA小片段的回收。本试验对比了两种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的方法（煮沸法和水浴法），并用无水乙醇和3mol/L醋酸钠共沉淀纯化DNA小片段。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测回收结果，通过紫外检测进行定量分析，结果显示：水浴法比煮沸法的回收率高。水浴法结合乙醇沉淀法还具有经济和操作简单的优点，可以广泛应用。关键词：非变性聚丙烯酰胺凝胶；DNA小片段；回收；纯化中图分类号：Q7文献标志码：A论文编号：2011-0003ComparativeStudyonTwoMethodsofRecyclingShortDNAFragmentsfromNondenaturingPolyacrylamideGelZhangLei,YuanLing,HuangJian’an,WuWenliang,ChenDongsheng,LiuZhonghua(KeyLabofTeaScienceofMinistryofEducation,HunanAgriculturalUniversity/NationalResearchCenterofEngineering&TechnologyforUtilizationofFunctionalIngredientsfromBotanical,Changsha410128)Abstract:RecyclingDNAfragmentsfrompolyacrylamidegelisacommontechniqueinmolecularbiology,especiallyforrecyclingDNAshortfragments.Inthisexperiment,twomethods(boilingmethodandwater-bathmethod)wereusedtoextractshortDNAfragmentswhichwereco-precipitatedwithabsoluteethanoland3mol/Lsodiumacetatetogether.Theresultswerecomparedbypolyacrylamidegelelectrophoresis.Atlast,shortDNAfragmentswasanalyzedbythemethodofultravioletabsorption.ItshowedthattherecoveryrateofshortDNAfragmentsinwater-bathmethodwashigherthanboilingmethod.Water-bathmethodcombinedwithethanolprecipitationforextractedshortDNAfragmentshadmanyadvantages,suchaseconomicalandconvenientwhichshouldbeadvocatedtousewidespread.Keywords:nondenaturingpolyacrylamidegel;shortDNAfragments;recovery;purification中国农学通报http://www.casb.org.cn实用方法尤为重要。本试验在前人的研究基础上，对比了两种从非变性PAGE胶中回收和纯化目标DNA（51bp）的简易方法。1材料与方法1.1材料1.1.1试验材料pBluescriptIISK(+)—PPREvector，PPRE是一段合成的长51bp的DNA片段，其中5'端含KpnI酶切位点，3'端含XhoI酶切位点。1.1.2试剂FastDigestKpnI(Fermentas)；FastDigestXhoI(Fermentas)；10×FastDigestBuffer(Fermentas)；双蒸水；丙烯酰胺；N,N'-亚甲基双丙烯酰胺；过硫酸铵；10×TBE；1×TBE；TEMED；LoadingBuffer（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰，40%蔗糖水溶液）...