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从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较VIP免费

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中国农学通报2011,27(7):227-230ChineseAgriculturalScienceBulletin0引言随着生命科学的飞速发展,对生命奥秘的探索已经深入到分子水平。从凝胶中回收DNA是分子生物学实验中经常遇到的问题,特别是对100bp以下的小片段的电泳回收更是分子生物学的重要内容。小片段DNA的回收一般采用分辨率较高的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)[1]。研究表明,从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度较高,可适用于分子生物学中较高要求的实验[2-4]。虽然目前有几种常用的回收方法[5-7],也有几家知名生物试剂公司开发了相应的试剂盒,但这些回收方法不是操作较繁琐就是回收成本较高。因此,探索一种操作相对简单、回收效率较高、回收成本较低的基金项目:国家自然科学基金“茶氨酸生物合成的基因转录调控研究”(3087157);湖南农业大学人才稳定基金“茶树重要功能基因的克隆与鉴定”(07WD22)。第一作者简介:章蕾,女,1986年出生,湖南浏阳,硕士在读。通讯地址:410128湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室,E-mail:zhanglei8665@163.com。通讯作者:刘仲华,男,1965年出生,湖南衡阳,教授,博士生导师,茶叶科学和药用植物资源功能成分研究。通信地址:410128湖南长沙湖南农业大学茶学重点实验室,E-mail:larkin-liu@163.com。收稿日期:2011-01-05,修回日期:2011-03-17。从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的两种方法比较章蕾,袁玲,黄建安,吴文亮,陈东生,刘仲华(湖南农业大学茶学教育部重点实验室/国家植物功能成分利用工程技术研究中心,长沙410128)摘要:从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段是分子生物学中的常用技术,尤其针对于DNA小片段的回收。本试验对比了两种从非变性聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA小片段的方法(煮沸法和水浴法),并用无水乙醇和3mol/L醋酸钠共沉淀纯化DNA小片段。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测回收结果,通过紫外检测进行定量分析,结果显示:水浴法比煮沸法的回收率高。水浴法结合乙醇沉淀法还具有经济和操作简单的优点,可以广泛应用。关键词:非变性聚丙烯酰胺凝胶;DNA小片段;回收;纯化中图分类号:Q7文献标志码:A论文编号:2011-0003ComparativeStudyonTwoMethodsofRecyclingShortDNAFragmentsfromNondenaturingPolyacrylamideGelZhangLei,YuanLing,HuangJian’an,WuWenliang,ChenDongsheng,LiuZhonghua(KeyLabofTeaScienceofMinistryofEducation,HunanAgriculturalUniversity/NationalResearchCenterofEngineering&TechnologyforUtilizationofFunctionalIngredientsfromBotanical,Changsha410128)Abstract:RecyclingDNAfragmentsfrompolyacrylamidegelisacommontechniqueinmolecularbiology,especiallyforrecyclingDNAshortfragments.Inthisexperiment,twomethods(boilingmethodandwater-bathmethod)wereusedtoextractshortDNAfragmentswhichwereco-precipitatedwithabsoluteethanoland3mol/Lsodiumacetatetogether.Theresultswerecomparedbypolyacrylamidegelelectrophoresis.Atlast,shortDNAfragmentswasanalyzedbythemethodofultravioletabsorption.ItshowedthattherecoveryrateofshortDNAfragmentsinwater-bathmethodwashigherthanboilingmethod.Water-bathmethodcombinedwithethanolprecipitationforextractedshortDNAfragmentshadmanyadvantages,suchaseconomicalandconvenientwhichshouldbeadvocatedtousewidespread.Keywords:nondenaturingpolyacrylamidegel;shortDNAfragments;recovery;purification中国农学通报http://www.casb.org.cn实用方法尤为重要。本试验在前人的研究基础上,对比了两种从非变性PAGE胶中回收和纯化目标DNA(51bp)的简易方法。1材料与方法1.1材料1.1.1试验材料pBluescriptIISK(+)—PPREvector,PPRE是一段合成的长51bp的DNA片段,其中5'端含KpnI酶切位点,3'端含XhoI酶切位点。1.1.2试剂FastDigestKpnI(Fermentas);FastDigestXhoI(Fermentas);10×FastDigestBuffer(Fermentas);双蒸水;丙烯酰胺;N,N'-亚甲基双丙烯酰胺;过硫酸铵;10×TBE;1×TBE;TEMED;LoadingBuffer(0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯氰,40%蔗糖水溶液)...

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