第三章 核酸的分离与检测VIP免费

Chapter3SeparateandinvestigatetargetgeneWellcometoGeneticEngineeringWellcometoGeneticEngineeringByNieguangjunE-mail:n.g.jason@163.com从哪儿提取（Where）？怎么提取（How）？提到什么程度（What）？会出现什么问题（Questions）？如何解决（Solution）？主要内容核酸提取的原则和基本要求PrincipleandstepsPrinciple1.保持核酸的完整性；2.提高核酸的质量（纯度和浓度）。Requirementsforpurification1.不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；2.其他事物大分子（Pr、sugarandlipid）3.其他核酸污染核酸提取的一般过程PrincipleandstepsSteps1.样品准备（取材）2.破细胞（物理法、化学法、酶法）；3.除杂质（蛋白质、脂类、糖类和不需要的核酸）；4.沉淀提纯I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中破碎细胞-方法1.机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；2.化学试剂法：用SDS或CTAB处理细胞；3.酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细胞壁破碎。破碎细胞-来源1.动物：小牛胸腺۰动物肝脏、血液和肌肉组织等۰鱼类精子；2.植物：种子的胚中都含有丰富的DNA。3.微生物：谷氨酸菌体含7%~10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%（培养过夜）。Note：从各种材料中提取DNA方法不同，分离提取的难易程度也不同。对于低等生物。如从病毒中提取DNA比较容易，多数病毒DNA分子量较小，提取时易保持其结构完整性。从高等动植物中提取DNA难度大一些。因分子量较大，易被机械张力剪断。破碎细胞（来源-方法）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂抽提核酸除去杂质1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类4．多糖的除去Howtoremove？核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。Howtodo？核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-HClpH8.01mmol/LEDTApH8.0关键试剂的作用关键试剂的作用核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。关键试剂的作用核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。关键试剂的作用核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。关键试剂的作用核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC关键试剂的作用核酸制备中常用的酶DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶核酸的部分特征核酸的部分特征1.存在形式2.pH值影响3.盐影响4.温度影响1.存在形式RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白...