枯草芽孢杆菌渗透压调节基因proB的克隆和表达VIP免费

!"卷"期"##"年!月微生物学报!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$$%&’!"()*+&,%’"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"##""通讯联系人作者简介：张小青（-./01），男，在读硕士生，目前从事分子微生物学方面的研究。收稿日期："##-2#32#!，修回日期："##-2#.2"3枯草芽孢杆菌渗透压调节基因.’(!的克隆和表达"张小青曹军卫"翟超陈建军（武汉大学生命科学学院武汉!0##/"）摘要：用456扩增的方法从耐盐的枯草杆菌中克隆出一个-7089长的:,(片段，经功能检测，证明正向插入片段与大肠杆菌的脯氨酸营养缺陷特性（!"#$1）能够营养互补。含有该重组质粒的大肠杆菌:;+>软件进行序列分析发现，该片段第-""?-"0<9)核苷酸编码一个由0/#个氨基酸组成的蛋白质分子，其上游存在非典型的1-#区，典型的10<区和核糖体结合位点，起始密码子处有最佳翻译起始效率的侧翼核苷酸序列。将其与@ABA9CB8中的已知基因的序列和编码的氨基酸序列进行同源性比较，结果表明该片段与枯草杆菌-3D的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别为D-=和.#=。证明该基因确实是一个!"#E基因。通过与三十个不同种属微芽生物!"#E基因的氨基酸序列比较，发现该蛋白存在有可能与形成酶的活性中心和三维结构有密切关系的几个绝对保守的区域。关键词：耐盐枯草芽孢杆菌，!"#E基因，克隆，序列分析中图分类号：F/D<文献标识码：(文章编号：###-23"#.（"##"）#"2#-302#3微生物在高渗环境的胁迫下，大多都可以合成或从环境中吸收一些低分子量物质来调节自身的渗透压以平衡外界渗透压的增高，这些低分子量物质，包括GH、糖类（海藻糖、蔗糖）、醇类、氨基酸及其衍生物（脯氨酸、甜菜碱）［-，"］。微生物中累积这些低分子量物质主要是通过运输途径和合成途径。目前已发现枯草芽孢杆菌与脯氨酸运输有关的蛋白有I)JK、4*%$、4*%L、4*%M、4*%N等［0，!］。而脯氨酸的合成在微生物中是由谷氨酸经过"2谷氨酰胺激酶（@G）、"2谷氨酰胺磷酸还原酶（@46）和#’2二氢吡咯2<2羧酸还原酶（4<56）三个酶催化而成，其中催化第一步的@G酶是脯氨酸合成代谢的限速酶。它是受终产物脯氨酸的反馈调节。因此@G酶活性的高低对脯氨酸的积累及与枯草芽孢杆菌耐渗透压能力的高低有关键影响［<］。本课题组对枯草芽孢杆菌不同菌株的耐盐能力进行了测定，发现它们的耐盐能力差别很大，其中枯草芽孢杆菌.0-<-的耐盐能力最高。对其胞内相溶溶质的研究发现，该菌株在不含,C5&和含-7!O%&PQ的,C5&的基本培养基中生长时，其自由氨基酸库中脯氨酸含量从几乎测不到增至0070ORPR，表明脯氨酸是枯草芽孢杆菌.0-<-的主要相容溶质物质［3］。本研究报道了枯草芽孢杆菌.0-<-的@G酶基因!"#E的克隆，对其进行了核苷酸序列分析，并在大肠杆菌中进行了功能测定。希望研究该基因与细胞渗透压调节的关系，为阐明耐盐微生物的耐盐机理奠定了基础。!材料和方法!"!材料!#!#!菌株和质粒：枯草芽孢杆菌（!"#$%%&’’&()$%$’）!"#$#，由中国典型菌种保藏中心（%%&%%）提供；大肠杆菌#’#($(［*!)#+,#*"+"!（%"#*+-!）+,#.］，购于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心（%+,%%）；大肠杆菌（/*#-%$）-.$!［’&*///!%"#0#0!（"1)%"#1!2#$）3’45#2+,#.%,64.%78+.!0)3$3#+,%"#］，由本实验室保存。4,-3&载体，由45%#1载体改造而成。!#!#$试剂和培养基：4,-3&载体克隆试剂盒，6%7扩增试剂盒，均购于&89878公司。低熔点琼脂糖购自:;<=8公司，限制性内切酶及其他试剂均购自华美公司。>?培养基按照文献［2］的方法配制。?,培养基成分为：（@.）(:A/#<，9(.6A/2<，9.(6A/"<，,<:A/·2.(A)’#<，葡萄糖#)<，用水定容至#)))=>。B,培养基是在?,培养基中加入柠檬酸三钠)’$。!#$方法!#$#!染色体-@D的制备：枯草芽孢杆菌!"#$#基因组-@D制备参照林万明的方法，用酚、氯仿进行纯化［1］。!#$#$引物设计及6%7扩增：登录+EF?8FG查找相关的*+-!基因序列，主要参考枯草芽孢杆菌#01的*+-!基因序列，运用6%C