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黑龙江生物科技职业学院生物制药技术生物分离技术主讲人：张爱华实训七、银耳多糖的制备及鉴定实验原理2材料用具3操作方法4目的要求211555注意事项目的要求了解银耳多糖制备的基本原理了解银耳多糖制备的基本原理掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术掌握糖类物质提取纯化的基本操作技术原理银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。银耳多糖主要成分为酸性杂多糖、中性杂多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五类，不含核酸、蛋白质类物质。可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB(溴化十六烷基三甲铵)络合法进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。可利用银耳子实体经水浸泡捣碎，酶浸提，乙醇沉析分离可制得银耳多糖粗品，再用CTAB(溴化十六烷基三甲铵)络合法进一步精制得银耳多糖纯品并进行多糖的鉴定。材料用具银耳子实体干品（50g左右）银耳子实体干品（50g左右）烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋、滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。烧杯、布氏漏斗、抽滤瓶、分液漏斗、量筒、离心机、恒温水浴锅、透析袋、滤纸、组织捣碎机、不锈钢锅。试剂（1）1％复合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)；（2）2％溴化十六烷基三甲铵（CTAB）配制：取2gCTAB溶于100mL蒸馏水中，摇匀备用；（3）α-萘酚配制：α-萘酚5g溶于95％乙（4）5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2mol／L的氢氧化钠溶液；（6）0.5％甲苯胺乙醇溶液；（7）2mol／L氯化钠溶液；（8）2mol／L盐酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1％融菌酶制剂；（11）无水乙醇；（12）浓硫酸；（13）乙醚。（1）1％复合酶制剂(含果胶酶、纤维素酶和中性蛋白酶食品级复合酶)；（2）2％溴化十六烷基三甲铵（CTAB）配制：取2gCTAB溶于100mL蒸馏水中，摇匀备用；（3）α-萘酚配制：α-萘酚5g溶于95％乙（4）5%三氯乙酸-正丁醇溶液；（5）2mol／L的氢氧化钠溶液；（6）0.5％甲苯胺乙醇溶液；（7）2mol／L氯化钠溶液；（8）2mol／L盐酸溶液；（9）活性炭；硅藻土。（10）1％融菌酶制剂；（11）无水乙醇；（12）浓硫酸；（13）乙醚。操作方法1.银耳预处理20g锈钢锅中加水1600mL20℃～25℃浸泡30min捣碎机中捣碎银耳浆液操作方法2mol／L盐酸溶液调pH至6.3加入1％复合酶制剂50℃下酶促反应40min银耳浆液2.酶浸提80℃灭酶，保温浸提约1.5h80℃水浴浓缩操作方法等体积5％三氯乙酸-正丁醇溶液摇匀离心（3000r/min）15min浓缩液3.多糖的沉淀（有机酸除杂）下层清液备用吸去上层正丁醇中层变性蛋白操作方法2mol／L的氢氧化钠溶液调pH至7摇匀抽滤3.多糖的沉淀（脱色、透析）下层清液备用加1％活性炭80℃加热15min脱色滤液扎袋流水透析12h80℃水浴浓缩抽滤操作方法加3倍量95％乙醇摇匀3.多糖的沉淀（乙醇沉析）抽滤液离心（3000r/min）15min沉淀用无水乙醇洗2次乙醚洗涤1次50℃以下真空干燥操作方法4.精制（一）取粗品1g溶于100mL水中搅拌静置2h2％CTAB滤液离心除不溶物60℃解离4h离心3000r/min15min80℃热水洗氯化钠2mol／L溶液100mL操作方法4.精制（二）解离液加三倍量95％乙醇透析液80℃浓缩离心3000r/min15min精品银耳多糖离心3000r/min15min沉淀用无水乙醇、乙醚洗涤上清液流水透析10h50℃真空干燥操作方法5.多糖的鉴定（一）观察硫酸层与糖溶液界面处颜色变化透析液1mLα-萘酚溶液2滴颜色变化摇匀沿管壁缓加入浓硫酸1.5mL(勿振动)操作方法5.多糖的鉴定（二）透析浓缩透析浓缩2mL点于滤纸0.5％甲苯胺乙醇溶液染色加入2％CTAB溶液2～4滴观察现象注意事项1.酶促反应的时间、温度应控制好。1.酶促反应的时间、温度应控制好。2.在制备全流程中应时刻注意温度，不能超过80℃2.在制备全流程中应时刻注意温度，不能超过80℃思考题1．加入复合酶制剂有何作用？1．加入复合酶制剂有何作用？2．CTAB络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？2．CTAB络合法与乙醇沉析法分离银耳多糖有何异同？3．为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过80℃？3．为何在制备全流程中应时刻注意温度不能超过80℃？