山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243-B页码：1/9制定人：审核人：批准人：颁发部门：日期：日期：日期：生效日期：分发部门：品质部、中心化验室、过程分析室目的：规范细菌内毒素检验操作程序。范围：适用于细菌内毒素检查操作。责任：品质部组织制定，中心化验室负责实施。内容1准备工作1.1实验设备及用具1.1.1刻度吸管、称量瓶、镊子、安瓿瓶（2ml、5ml）、药匙、250℃烘烤1小时。1.1.2干燥箱、恒温水浴锅、漩涡混合器、精密天平。1.1.3剪刀、砂轮片、医用胶布、洗耳球、试管架、脱脂棉球、水银温度计、试管1.2内毒素标准品与实验试剂1.2.1鲎试剂：在使用前应进行灵敏度测定，原则上购进一个批号测定一次。1.2.2细菌内毒素检查用水（内毒素含量＜0.015Eu/mL灭菌注射用水）。1.2.3细菌内毒素国家标准品和工作标准品。1.2.475%乙醇、铬酸洗液。1.3实验用具的消毒处理：凡是参与实验样品或试剂接触的器具，在实验前必须经除细菌内毒素处理，将洗净的器具经纯化水冲洗后，在250℃干热灭菌至少60分钟。1.4恒温水浴箱内水浴温度调节到37±1℃。2鲎试剂灵敏度复核2.1根据鲎试剂灵敏度的标示值（如：λ=0.25EU/ml），细菌内毒素工作标准品加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，在漩涡混合器上混匀15分钟。2.2将工作标准品制备成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四个浓度（0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml）的内毒素标准溶液，备用。例：工作标准品为160EU/ml时注意：每稀释一步均应在混合器上混匀30秒。山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243-B页码：2/9160EU/ml标准品溶液0.2ml16EU/ml0.5ml8EU/ml0.5ml1.8ml0.2ml1.4ml1EU/ml0.9ml0.9ml0.5EU/ml0.9ml0.9ml0.25EU/ml0.9ml0.9ml0.125EU/ml0.9ml0.9ml0.06EU/ml2.3取18支0.25EU/ml鲎试剂，每支中加入0.1mlBET水，然后分别加入0.1ml2.2中制备好的4个浓度的标准液,按浓度从高到低依次加入，每个浓度加4支，；最后2支加入0.1mlBET水作阴性对照。2.4将上述试管用医用胶布封口，垂直放入37℃±1℃水浴锅中，保温60±2分钟。放入水浴前把水搅动几下，以使水温均匀。再次检查温度是否在所要求的范围，注意保温和取放过程应避免受到振动造成的假阴性结果。2.5保温结束后将试管轻轻取出，缓缓转到180°，若关内形成凝胶，不变形、不从管壁滑落者为阳性；未形成凝胶或形成凝胶变形从壁滑落者为阴性。（注意：保温盒拿取试管过程应避免受到震动而造成的假阴性结果）2.6结果判定当最大浓度2λ4支管均为阳性，最低浓度0.25λ4支管均为阴性，阴性对照2支管为阴性，实验方有效。如图1按下述公式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值λc。当λc在0.5λ-2λ时，方可用于细菌内毒素的检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。式中：X为反应终点浓度的对数值lg。反应重点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。antilg是lg函数的反函数，在excel里可以用power公式，power（数值）2.7举例设待复核鲎试剂的灵敏度为0.25EU/ml，即λ=0.25EU/ml。实验结果如下：内毒素浓度（EU/ml）0.500.250.1250.062Nc反应终点浓度X1++---0.25山东天力药业有限公司标题：细菌内毒素检测操作程序编号：SOP-QM-243-B页码：3/9λc=antilg(Σx/4)2+----0.503+++-0.1254+++-0.125则：λc=antilg(∑X/4)=antilg[（lg0.25＋lg0.50＋lg0.125＋lg0.125）/4]=antilg[(-0.602-0.301-0.903-0.903)/4]=antilg(-0.508)=0.310（EU/ml）λc在0.5λ-2λ范围内，符合规定。结果不是内毒素最大浓度（2λ）4管全部阳性，最小浓度（0.25λ）4管全部阴性，本批鲎试剂不能使用。需查找原因，可能是灵敏度标示不准确或内毒素效价标示不准确，或操作不当所致。3.干扰实验干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。3.1制备内毒素标准对照溶液取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ。3.2制备含内毒素的供试品溶液将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释...
