细胞划痕试验VIP免费

直尺20微升枪头（灭菌）无血清培养基PBS准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）流程：1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。NOTE6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1ug/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。照片拍完之后，可以用imageJ来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。另，imageJ哪里有下载么？谢谢。ImageJ下载网址：http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢目前最好的方法还是transwell法一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。2。细胞有极性，方便测量，观察。3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。wuusharkwrote:现在好多SCI杂志都不认这个实验了，要求做transwell了。这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。Photoshop6.0以前的版本有个直方图的功能可以直接反映选择区域的象素多少，用来做面积分析应当很好用，用于做划痕修复的实验应当也很好用，当然，有更专业的ImageProPlus的话PS就没必要了。tacthginwrote:本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？我个人认为选择scratchassay或者是transwellassay是根据所研究的细胞系的特点来决定的。上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratchassay很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。neutrophil,monocyte/macrophage,mesenchymalstemcell,这类细胞在生理状态下并不形成monolayer,病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwellassay模拟了这种运动形式，是适合的模型。非常同意，tacthgin战友的思想。其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞...