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大肠杆菌的培养VIP免费

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大肠杆菌种子液的制备牛肉膏蛋白胨培养基的配方:液体培养基牛肉膏3.0g蛋白胨10.0g氯化钠5.0g水1000mlpH7.4-7.6固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5%-2.0%的琼脂1试管斜面与平板的制备(1)称量按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。(2)熔化在上述烧杯中先加入少于所需要量的水,用玻璃棒搅匀,然后,在石棉网上加热使其溶解,药品完全溶解后,补充水到所需的总体积。将称量好的1.8%琼脂放入已溶的药品中,再加热熔化,最后补充所损失的水分。(3)调PH在未调PH前,先用精密PH试纸测量培养基的原始PH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用PH试纸测基PH直到PH达到7.4-7.6。反之用1mol/LHCl进行调节。(4)分装将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5,三角烧瓶的量不超过1/2加塞培养基分装完毕后,在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。(5)包扎加塞后,将全部试管用麻绳捆好,再在棉塞外包一层牛皮纸,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。(6)灭菌将上述培养基以0.1Mpa,121℃,15min高压蒸气灭菌。(7)倒平板,取三个已消毒的培养皿,在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基,冷却。(8)搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右,将试管口端搁在玻璃棒上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。2接种大肠杆菌斜面种子(1)取实验室储备的大肠杆菌BL21种子,在酒精灯附近,用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。(2)将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。3制备平板种子(1)在无菌条件下,取一支保存的大肠杆菌的斜面,用无菌生理盐水将菌种冲洗下来,再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍,10倍,100倍和1000倍,用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板,每次吸取溶液100ul),然后在37℃培养箱中过夜。(12)次日,挑取生长状态好,特征明显的单个菌落,接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃,170r/min恒温振荡培养18h作种子培养液。其后的实验中,每次实验前从种子培养液中吸取2ml菌液接种于新鲜灭菌的液体培养基中,37℃,170r/min恒温振荡培养使用牛肉膏蛋白胨培养基组成成分:牛肉膏3g,蛋白胨10g,Nacl5g,琼脂15~20g,水1000mL,PH7.4~7.6。具体配置步骤:1.称药品按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速.2.加热溶解在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分.3.调pH检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/LHCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度.4.过滤液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略.5.分装按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染.分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝.6.加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞.7.包扎加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一...

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