经典蛋白含量测定方法比较及双缩脲法实验步骤简介VIP免费

实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度实验四、双缩脲法测定蛋白质的浓度N端C端相关知识相关知识目前常用的有五种经典方法：目前常用的有五种经典方法：定氮法：灵敏度0.2~1.0mg双缩脲法（Biuret法）：1~20mgFolin－酚试剂法(Lowry法)：50~100μg紫外吸收法：5μg考马斯亮蓝法（Bradford法）：1~5μg方法方法灵敏度灵敏度时间时间原理原理干扰物质干扰物质说明说明凯氏定氮法(Kjedahl(Kjedahl法法))灵敏度低灵敏度低,,适用于适用于0.20.2~1.0mg~1.0mg氮氮,,误差为误差为22％％费时费时88～～1010小小时时将蛋白氮转化为将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后氨，用酸吸收后滴定滴定非蛋白氮非蛋白氮((可用可用TCATCA沉淀蛋白质沉淀蛋白质而分离而分离))用于标准蛋白质用于标准蛋白质含量的准确测定含量的准确测定;;干扰少干扰少;;费时太长费时太长双缩脲法双缩脲法(Biuret(Biuret法法))灵敏度低灵敏度低11～～20mg20mg中速中速20~3020~30分钟分钟多肽键＋碱性多肽键＋碱性Cu2Cu2＋＋紫色络紫色络合物合物硫酸铵硫酸铵;Tris;Tris缓冲液；某缓冲液；某些氨基酸些氨基酸用于快速测定用于快速测定,,但但不太灵敏不太灵敏;;不同不同蛋白质显色相似蛋白质显色相似紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏较为灵敏5050～～100100gg快速快速55～～1010分分钟钟各种蛋白质中的各种蛋白质中的TyrTyr和和TrpTrp残基残基在在280nm280nm处的处的光吸收光吸收嘌吟和嘧啶；嘌吟和嘧啶；各种核苷酸各种核苷酸用于层析柱流出用于层析柱流出液的检测；核酸液的检测；核酸的吸收可校正的吸收可校正FolinFolin－酚－酚试剂试剂法法(Lowry(Lowry法法))灵敏度高～灵敏度高～55gg慢速慢速4040～～6060分分钟钟双缩脲反应双缩脲反应;;磷钼酸－磷钨酸磷钼酸－磷钨酸试剂被试剂被TyrTyr和和PhePhe还原还原硫酸铵硫酸铵;;TrisTris缓冲缓冲液液;;甘氨酸甘氨酸;;各种硫醇各种硫醇耗费时间长；操耗费时间长；操作要严格计时；作要严格计时；颜色深浅随不同颜色深浅随不同蛋白质变化蛋白质变化考马斯亮蓝考马斯亮蓝法法(Bradford(Bradford法法))灵敏度最高灵敏度最高11～～55gg快速快速55～～1515分分钟钟考马斯亮蓝染料考马斯亮蓝染料与蛋白质结合与蛋白质结合时时,,其其maxmax由由465nm465nm变为变为595nm595nm强碱性缓冲强碱性缓冲液；液；TritonTritonX-100;SDSX-100;SDS最好的方法最好的方法;;干干扰物质少扰物质少;;颜色颜色稳定稳定;;颜色深浅随颜色深浅随不同蛋白质变化不同蛋白质变化一、实验目的一、实验目的掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理掌握双缩脲法定量测定蛋白质含量的原理和方法。和方法。进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原进一步掌握紫外和可见光分光光度计的原理和使用方法。理和使用方法。加热＋NH322H－180℃双缩脲双缩脲2222二、实验原理二、实验原理双缩脲反应:碱性环境碱性环境H2OO=CC=OHNNHR-CHCH-RO=CCuC=OHNNHR-CHCH-RH2O紫色络合物含有两个或两含有两个或两个以上肽键的个以上肽键的化合物均有双化合物均有双缩脲反应缩脲反应蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与反应。在碱性溶液中蛋白质与CuCu2+2+形成紫红形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，因此被广泛地应用。关，因此被广泛地应用。在一定的实验条件下在一定的实验条件下,,未知样品的溶液与标未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应准蛋白质溶液同时反应,,并于并于540540－－560560nmnm下比色下比色,,可通过标准蛋白质的标准曲线求出可通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。未知样品的蛋白质浓度。除－除－CONHCONH－－有此反应外，－有此反应外，－CONHCONH22，，－－CHCH22－－NHNH22，－，－CSCS－－NHNH22等亦有此反等亦有此反应。应。三、实验仪器、材料和试剂三、实验仪器、材料和试剂（一）仪器（一）仪器吸量管吸量管(1ml/2ml/5ml)(1ml/2ml/5ml)、试管及试...