酸性成纤维细胞生长因子对庆大霉素和顺铂所致肾小管上皮细胞损伤的拮抗效应VIP免费

http://www.paper.edu.cn-1-酸性成纤维细胞生长因子对庆大霉素和顺铂所致肾小管上皮细胞损伤的拮抗效应1刘华钢1，黄巨恩2，刘丽敏1，王慧杰2，胡文娟2，李校堃3，肖健31广西医科大学药学院，南宁（530021）2广西医科大学组织学与胚胎学教研室，南宁（530021）3温州医学院生物与天然药物研究院，浙江温州（325027）E-mail：hgliu@263.net摘要：目的研究酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对庆大霉素（GM）和顺铂(DDP)引起的体外培养的肾小管上皮细胞损害的保护作用。方法：大鼠肾皮质经研磨、过网、胰蛋白酶消化，进行肾小管上皮细胞的体外培养。经Cytokeratin18抗体进行鉴定后，用GM、DDP建立损伤模型，观察aFGF对损伤的肾小管上皮细胞的保护作用。结果：①经形态学观察、GM或DDP组与对照组比较，CAT、SOD、GSH-Px、Na＋－K＋－ATP酶活性下降，而NAG活性和NO、MDA升高（(P<0.01或P<0.05)，提示肾小管上皮细胞的培养和GM、DDP损伤的建模成功。②aFGF+GM或DDP组与GM组比较，大多数生化和酶学指标有显著或非常显著性差异(P<0.05或P<0.01)；而aFGF+GM或DDP组与对照组比较，CAT、NAG、GSH-Px、Na＋－K＋－ATP酶活性无显著性差异，但SOD活性下降、NO、MDA升高尚有显著性差异(P<0.05)。结论aFGF对GM、DDP损伤的肾小管上皮细胞有明显的保护作用。关键词：酸性成纤维细胞生长因子，顺铂，肾小管上皮细胞，细胞培养中图分类号：R-332R322.61以庆大霉素(Gentamicin,GM)为代表的氨基糖甙类抗生素主要作用于革兰氏阴性细菌，因其抗菌谱广、疗效价且费用低廉而广泛应用于临床，但由于血清有效浓度与毒性浓度相近，毒性作用的发生率高；而顺式二氯二氨铂或简称顺铂(Cisplatin,DDP或CDDP)是一种广谱、有效的抗癌药物，其疗效与用药剂量成正比。尽管GM和DDP在分子结构、作用机理和临床适应症等方面都存在很大的差异，但在副作用方面却很相似，即过量使用都会引起严重的肾毒性和耳毒性，这也是它们临床应用受限的主要原因[1-2]。本研究用原代培养的大鼠肾小管上皮细胞制作GM、DDP肾损伤模型，观察aFGF的作用，并探讨其可能的机制，为临床应用提供依据。1.材料与方法1.1实验动物和试剂实验使用SD大鼠40只，体重约50g，由广西医科大学实验动物中心提供。新生小牛血清由杭州四季青公司提供；DMEM培养基由Gibco公司提供；胰蛋白酶由Sigma公司提供；抗细胞角质素(Cytokeratin18)抗体、SABC、DAB试剂盒由武汉博士德公司提供；硫酸庆大霉素由广西南宁市百合药业集团有限公司产品（批号0504004）；DDP为江苏豪森药业股份有限公司产品（批号051003）；基因重组人酸性成纤维细胞生长因子(rh-aFGF)由暨南大学生物工程研究所提供（批号20050618）；丙二醛(MDA)测定试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒、超氧化物歧化1本课题得到国家重点基础发展规划项目（973项目）（G199954204）的资助。http://www.paper.edu.cn-2-酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒、N-乙酰氨基-β-D葡萄糖苷酶(NAG)测定试剂盒、ATP酶测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。1.2实验方法和步骤1.2.1肾小管节段的分离、消化断头处死大鼠，无菌条件下取肾，将肾皮质分离后洗净剪碎,用PBS平衡盐溶液清洗几次。将洗净的肾皮质剪成1～2mm大小的组织块,用0.25%胰蛋白酶37℃消化10min,消化后的细胞悬液离心800r·min-1，5min。弃上清液，将沉淀再消化20min。显微镜下观察直至肾小管节段变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。其悬液用200目的尼龙细筛过滤,滤去较大的组织块。滤液1000r·min-1离心5min弃上清液。将沉淀重悬于DMEM培养液中离心800r·min-1,5min，洗涤3次,所得沉淀即为分离的肾小管上皮细胞。1.2.2肾小管上皮细胞的培养加入5ml含有10%新生小牛血清的DMEM培养液，充分吹打直到肾小管节段分散为细胞悬液为止。调整细胞密度为1×104个/ml，将细胞悬液移入96孔细胞培养板，37℃，5%CO2培养箱培养。24ｈ后首次换液，倒置相差显微镜观察，围绕肾小管节段有卵圆型上皮样细胞长出，呈岛屿状向四周逐渐扩增，细胞形态呈鹅卵石样。以后视细胞生长情况于48或72h后再次换液。细胞于72至120h处于对数生长期，可用于实验。1.2.3肾小管上皮细胞的鉴...