人成纤维细胞稳定转染的方法比较VIP免费

四川大学学报(医学版)20∞；39(4)：654—65JSichuanUniv(MedSciEdi)7⋯V，●⋯人成纤维细胞稳定转染的方法比较*芦小燕1’2，解慧琪1，李莉2，智伟2，陈晓禾1，邓力1A1．四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室千细胞与组织工程研究室(成都610041)I2．四川大学华西药学院药理系【摘要】目的采用3种不同的方法将质粒pEGFP—N，转染人成纤维细胞，从中寻找最佳的稳定转染的方法。方法分别采用阳离子聚合物转染、阳离子脂质体转染和电转染方法，将能表达G418抗性蛋白和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒pEGFP—N。转染人成纤维细胞。24h后，荧光显微镜下观察EGFP表达，流式细胞术测定瞬时转染率；通过G418筛选得到稳定转染的细胞。结果电转染有最高的瞬时转染效率(56．8％)，稳定转染得到的阳性克隆最多，且从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间也最少(约20d)；用阳离子聚合物瞬时转染率低(1．7％)，稳定筛选同样可以得到阳性大克隆，但是数量很少且从细胞筛选到扩增至阳性大克隆所用的时间也最多(约30d)；阳离子脂质体转染效果居中，瞬时转染率为39．9％，从细胞筛选到扩增至得到阳性大克隆所用的时间约25d。结论用电转染法将质粒pEGFP—N-转染人成纤维细胞是最佳的转染方法。【关键词】人成纤维细胞稳定转染电转染阳离子聚合物转染阳离子脂质体转染【中图分类号】R331StablyTransfectionofDNAtoHumanFibroblasts：AComparativeStudyofThreeApproachesLUXiao-yan，XIEHui-qi。LILi，ZHIWei，CHENXiao—he，DENGLi△．DivisionofStemCellandTissueEngineeting，StateKe，LaboratoryofBiotherapy，westChinaHospital·SichuanUniversity，Chengdu610041，China[Abstract]ObjectiveTosearchforthebestapproachestotransfectplasmidpEGFP-Nlintohumanfibroblasts．MethodsCationicpolymermediatedtransfection。cationicliposometransfeetionandelectrotransfectionwerecomparedfortransfectingplasmidpEGFP-Nl，aplasmidthatexpressesG418resistanceproteinandEnhancedgreenfuluorescentprotein(EGFP)，intoHumanfibroblasts．TheexpressionofEGFPwasobserved24hoursafterthetransfeetionbyfluorescencemicroscope．Thetransienttransfectionefficiencywasmeasuredbyflowcytometry．ThestabletransfectedcellswerescreenedbyG418．ResultsElectrotransfectionhadthehighesttransienttransfectionefficiency(56．8％)，withthemostmascclonesofstablytransfectionandtheleasttimetakentoformbigmascclones(20days)．Cationicpolymermediatedtransienttransfectionhadthelowestefficiency(1．7％)，withtheleastmascclonesandthelongesttimetakentoformthebigmascclones(30days)．Cationicliposometransfectionhadatransienttransfectionefficiencyof39．9％andtook25daystoformthebigmascclones．ConclusionElectrotransfectionisthebestwayofstablytransfectingplasmidpEGFP-Nlintohumanfibroblasts．【Keywords]HumanfibroblastsStabletransfectionElectrotransfectionCationicpolymermediatedtransfectionLiposometransfection通过生长因子等因素的调节，成纤维细胞在肉芽形成、基质合成、创伤修复、瘢痕形成及无瘢痕愈合方面均起重要作用，因而有很多研究者通过转染各种目的质粒到成纤维细胞中以达到研究其在创伤修复中的作用的目的。如何高效、无害地将目的基因导入靶细胞达到稳定转染的目的是转染技术的关键。目前基因转染的方法有多种，其中以脂质体转染法、阳离子聚合物转染和电转染法较为常见。本研究拟采用这3种转*国家自然科学基金(批准号30670734)资助ACorrespondingauthor，E—mail}dengli2000@210n．com染方法，分别将具有双筛选标记的质粒pEGFP—Nt转染到人成纤维细胞中，比较选出最佳的稳定转染的方法，为进一步稳定转染其他具有筛选标记的目的质粒到人成纤维细胞打下基础。1材料与方法1．1材料人成纤维细胞取自小儿包皮环切术得到的包皮组织(组织按照合法程序征得同意后获得)；培养基DMEM／Ham’SF12(GIBCO)；胎牛血清(HYCLONE)；质粒pEGFP-NI(Clontech)；感受态菌...