重组人胰岛素制备工艺VIP免费

第39卷第4期2007年7月四川大学学报(工程科学版)JOURNALOFSICHUANUNIVERSITY(ENGINEE~NGSCIENCEEDITION)V01．39No．4July2007文章编号：1009—3087(2007)04-0079-05重组人胰岛素制备工艺李晓红，朱惠玲，余蓉，李红霞(四川大学华西药学院，四川成都610041)摘要：为了提高重组人胰岛素的表达量，用Ecoli发酵表达(His)一Ars—Arg一人胰岛素原[(His)一Ars—Arg—humanproinsulin，RRhPI]，并对影响RRhPI高效表达的各主要因素以及下游纯化工艺的各关键步骤进行优化。研究表明，RRhPIEcoli在最优培养基：5g／L胰蛋白胨，2g／L谷氨酸，7g／L酵母浸膏，0．5g／L酸铵，2．5g／L葡萄糖，2．7g／L甘油，100mg／L氨苄青霉素，50mg／L卡那霉素，pH7．2的条件下，用发酵罐进行发酵，在对数生长中期加入0．5mmo~LIPTG诱导4h，发酵过程中通过补料和转速调节，每升培养基能收获湿菌体51．2g，包涵体16．2g。在下游纯化工艺中，初步纯化前包涵体溶解液中一定浓度的B一巯基乙醇以及复性液中一定浓度的氧化型谷胱甘肽将有助于RRhPI的复性。经过工艺条件的优化，人胰岛素最终收率可达74mg／L培养基。关键词：(His)一Ars—Arg一人胰岛素原；重组人胰岛素；大肠杆菌中图分类号：Q578；Q786文献标识码：APreparationofRecombinantHumanInsulinL／Xiao—hong，ZHUHui—ling，YUR0，UHong—xia(WestChinaSchoolofPharmacy，SichuanUniv．，Chengdu610041，China)Abstract：Toobtainrecombinanthumaninsulin(rhI)，(His)6一Arg—Arg—humanproinsulin(RRhPI)wasex—pressedbyEscherichiacoli(E．coli)．Intheoptimummediumof5g／Ltryptone，2g／Lglutamicacid，7g／Lyeastextract，0．5g／Lammoniumsulfate，2．5g／Lglucose，2．7g／Lglycerol，100mg／Lampicillin，50mg／Lkanamycin，andpH7．2，andwiththeadditionof0．5mmol／LWrGatintermediateexponentialphaseandinductionfor4h，51．2gwetE．coliand16．2ginclusionbodywereharvestedfrom1Lmediuminfermenter．TheresultsshowedthatcertainconcentrationofB—mercaptoethanolininclusionbodysolutionandoxidizedglutathioneinrefoldingsolutionwerehelpfultoRRhPIrefolding．Withthewell—optimizedtechnology，74mgrh1wasobtainedfrom1Lcultureme—diam．Keywords：(His)6一Arg—Arg—humanproinsulin；recombinanthumaninsulin；E．coli目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nanthumaninsulin，rhI)的方法主要有3种：1)用基因工程大肠杆菌(Escherichiacoli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(humaninsulin，hi)的A、收稿日期：2006—01—20基金项目：科技部创新基金资助项目(06C26215100476)作者简介：李晓红(1973一)，女，讲师，研究方向：微生物与生化药学．B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。这一方法缺点较多，目前已较少使用；2)用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—manproinsulin，hPI)，后经加工形成hI。E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；维普资讯http://www.cqvip.com80四川大学学报(工程科学版)第39卷3)通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—humanproinsulin，RRh—PI]，后加工成hI的制备工艺。1实验部分1．1菌种RRhPIZpQE一40E．coliM15菌株...