·基础研究·纤维蛋白用做骨组织工程载体并修复骨缺损△陈克明葛宝丰刘兴炎白孟海王勇摘要:[目的]研究将纤维蛋白用做骨组织工程的载体材料。[方法]将兔骨髓基质干细胞(BMSCs)在体外大量培养扩增后,与同种兔纤维蛋白制成凝胶复合物,对复合物进行成骨性诱导培养,观察细胞增殖与分化情况。进而将含自体BMSCs的复合物填充于兔桡骨节段性缺损区,观察其对骨缺损的修复效果。[结果]BMSCs与纤维蛋白复合物在体外培养条件下可保持完整形状、细胞大量增殖,并发生成骨性分化和分泌钙盐。植入复合物的骨缺损区修复效果显著优于植入单纯纤维蛋白。[结论]纤维蛋白可为BMSCs提供良好的增殖与分化环境,二者复合物可用于组织工程法修复骨缺损。关键词:骨髓基质干细胞;纤维蛋白;载体;组织工程Applicationoffibrinascarrierforbonetissueengineeringandrepairofbonedefect∥CHENKe2ming,GEBao2feng,LIUXing2yan,etal.InstituteofOrthopaedics,LanzhouGeneralHospital,Lanzhou730050Abstract[Objective]Toinvestigatethepossibilityofusingfibrinascarrierforbonetissueengineering.[Method]Rab2bitmarrowmysenchymalstemcells(BMSCs)wereexpandedbyinvitrocultureinlargescaleandentrappedinfibringels.ThegelswereculturedandthecellsinthegelwerestudiedbymeasurementoftotalDNAandcalciumcontent.Thegelscontainingautolo2gousBMSCswereimplantedintotheradiusdefectofrabbits.Thereparativeeffectwasobservedradiologicallyandpathologically.[Result]Thegelshapewaskeptduringculture.BMSCsinthegelspropagatedrapidlyanddifferentiatedintoosteoblasts,whichwasmarkedbytheincreaseoftotalDNAandcalciumcontent.ThedefectsfilledbygelscontainingautologousBMSCshealedfarmorebetterthanthatfilledonlybyfibrin.[Conclusion]FibrinprovidessuitableenvironmentfortheproliferationandosteogenicdifferentiationofBMSCs.ThecompositionoffibrinandBMSCscanbeappliedinbonetissueengineering.KeywordsMarrowmysenchymalstemcells;Fibrin;Carrider;Tissueengineering△本课题为:全军“十五”规划青年基金(01Q012)和甘肃省自然科学基金(ZS0212A2520912Y)资助项目作者单位:兰州军区兰州总医院骨研所,兰州730050电话:(0931)8975291载体材料是组织工程中种子细胞增殖、分化和发挥生理功能的场所,也是生长因子的分布与缓释体。作者以前已经证明,纤维蛋白是一种理想的骨形态发生蛋白(Bonemor2rphogeneticprotein,BMP)载体材料[1]。为探索用骨髓基质干细胞(Bonemarrowmysenchymalstemcells,BMSCs)、纤维蛋白和BMP三者联合开展骨组织工程,本实验进一步研究了纤维蛋白用做骨髓基质干细胞载体的可行性。1材料与方法1.1BMSCs的培养扩增兔BMSCs的分离、培养和扩增方法同以前报道[2]。将抽取自兔股骨髁的骨髓用淋巴细胞分离液离心,分离出单核细胞后悬浮于含10%胎牛血清(兰州民海)的MEM培养液中,按3×105/cm2接种于100mm培养皿(Costar)。静置培养5d,然后PBS洗1遍,换新鲜培养液继续培养。每周换2次培养液,当皿底出现的梭形细胞克隆间接近融合时,用0.25%胰蛋白酶—1mmol/LEDTA混合消化液消化处理,1∶3传代。1.2复合物的制备、培养与指标检测1.2.1复合物的制备与培养采用冷沉淀法提取同种异体兔纤维蛋白原,方法同以前报道[2]。用四蒸水溶解后,配成1.2g/L的浓度。将培养至第3代并长满皿底的兔BMSCs用混合消化液消化,离心收集细胞,PBS洗1遍后悬浮于纤维蛋白原溶液中,细胞浓度调整至1×106/ml。将细胞悬液以200μL/孔滴入96孔培养板,每孔再滴加等体积500U/ml的凝血酶,边加边震荡,直至形成淡黄色的凝胶。用眼科镊将凝胶逐个完整地取出,转入30mm培养皿中,每皿4个。加含有骨诱导剂(10mmol/Lβ2磷酸甘油,1028mol/L地塞米松和100mmol/L磷酸抗坏血酸)的MEM培养液,每皿2ml,于37℃、5%CO2和饱和湿度条件下培养。1.2.2细胞增殖与分化分析细胞增殖情况用细胞内总DNA含量的变化来表示[3]。于培养第1、4、7d分别取出8块凝胶复合物,用PBS洗涤·1421·中国矫形外科杂志2005年8月第13卷第16期OrthopJChin,Vol.13,No.16August2005后转入1...
