238应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质胡晓洁王敏刘德莉刘伟曹谊林·实验研究·TissueengineeringofcornealstromawithGFPmarkedcellsHuXiaojie，WangMin，LiuDeli，eta1．DepartmentofPlasticSurgery，ShanghaiNinethHospital，ShanghaiTissueEngineeringResearchCenter，ShanghaiSecondMedicalUniversity，Shanghai200011AbstractObjectiveToreconstructcornealstronlawithculturedcellsandtracetheculturedcellshyGreenFluorescenceProtein(GFP)genetransfection．MethodsCornealstronlalcellswereisolatedfronlnewbornrabbit¨)rneaandwereculturedandexpandedinvitro．Atthetimeofreachingconfluency，cornealstromalcellswerenlixedwithPolyglieolicAcid(PGA)toforillacell—scafroIdconstruct．At1weekaftercuhure．theconstructswereinlplantedintonlotherrabhitcornealstromaandportionsofcornealstronlalcellsweretransfectedwithGFPgenetonlarktheseedcellsbyretroviralvector．Tissueswereharvestedat8weeksforhistologieevaluation．ResultsTheengineeredtissueproceededtobecometransparentoveran8-weekperiod．Stronlaengineeredincornearevealedthehistologyoflanlellarrelativelysinlilartothatofnaturalstronla．Additionally，agreencolnredstromawasobservedwhenengineeredwithGFP—labeledcellsunderfluorescencelightmicroscope．suggestingthatthestronlawasconstitutedbyimplantedcells．ConclusionsTheresultsdemonstratethatstronlacouldbeengineeredinrecipientcorneaandtheeonlposedcellsoriginalefromculturedcells．Keywordstissueengineeringcornealstromagreenfluorescenceprotein摘要目的应用基因转染技术将绿色荧光蛋白(GtP)标记角膜基质绌胞，以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪、方法构建携带EGFP基I的重组逆转录病毒载体PLNCX2一EGFP，转染兔角膜基质细胞，然后将该细胞接种于PGA，形成细胞一生物材料复合物，移植于母兔角膜基质饭层内术后8刷，组织学切片，HE染色，荧光显微镜卜对绿色荧光蛋A(GFP)进行示踪观察。结果8_l吉J后，组织化角膜组织形成，组织学切片显示PGA完全降解，新生组织形成，组织排列规整，荧光显微镜下新生组织呈绿色，提示EGFP表达。结论组织丁程角膜基质的组织学结构与角膜皋质相类似。新牛组织表达CFP，证实组织丁程角膜基质组织的构成源r供体细胞。关键词组织丁程角膜基质绿色荧光蛋白分类号R772同种异体角膜移植是目前治疗角膜肓最常用、最有效的治疗方法，但面临移植材料来源匮乏的难题，限制了它的临床应用。近来，随着生命科学、材料科学以及相关物理、化学学科的发展，人们提出了一个新的概念——组织工程。它是应用细胞生物学和工程学原理，研究开发修复、改善损伤组织结构和功能的生物替代物的一门技术。此项技术已成功地构建了骨、软骨、皮肤等组织，在临床上获得了初步应用，证实本课题为973同家重点基础研究项日(1999054309)作者单位：200011上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科第二医科大学组织工程研究中心通讯作者：曹谊林(Emai：hxjie2002@hotmailCOf1)了组织二[程技术构建组织的可能性。能否应用组织工程技术构建角膜组织，开拓角膜供体来源，逐渐成为新的研究热点⋯。本实验尝试应用组织T程技术构建角膜基质组织，并通过基冈转染方法用绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质细胞示踪构建过程。1材料与方法1．1材料逆转录病毒载体(PLNCX2，6．1kb，Clontech公司)；含增强型绿色荧光蛋白的质粒pEC—EGFP(6．7kb，GFP长2．3kb，由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠)；PT包装细胞(Clotech公司)；NIH3T3细胞维普资讯http://www.cqvip.com眼科研究2003年6月第21卷第3期(ATCC公司)；G418(Sigma公司)；Polybrene(Sigma公司)；脂质体转染试剂Lipofectamin(Gibco公司)。1．2构建携带EGFP基的重组逆转录病毒载体PLNCX2一EGFPpEC—EGFP(6．7kb)用限制性内切酶HindⅢ和NotI双酶切，低熔点胶分离，回收纯化2．3k1]的GFP基因片段。将GFP基凶片段定向插入已进行相应酶切(Hind11I和NotI)的逆转录病...
