外源核苷酸对肠上皮细胞增殖和迁移的作用_陈祥贵 (1)VIP免费

四川工业学院学报JournalofSichuanUniversityofScienceandTechnology文章编号:100025722(2003)增刊20081205收到日期:2003209226本文曾发表于《卫生研究》,2002,31(3):168～171,被Medline检索作者简介:陈祥贵(19662),男,四川省资阳市人,西华大学生物工程系副教授,医学博士后,主要从事营养学、细胞与分子生物学研究。外源核苷酸对肠上皮细胞增殖和迁移的作用陈祥贵1,王瑞淑2,邓茂先2,冉新泽3,粟永萍3(11西华大学生物工程系,四川成都610039;21四川大学华西公共卫生学院,四川成都610041;31第三军医大学预防医学系,重庆400038)摘要:目的:本研究通过对体外培养的大鼠小肠上皮细胞IEC-6添加核苷酸,探讨四种单核苷酸及其按母乳组成模式配制的核苷酸混合物对肠上皮细胞增殖和损伤后迁移的影响。方法:采用MTT法测定核苷酸对细胞增殖的浓度-效应和核苷酸之间对细胞增殖效应的相互作用;采用IEC-6单层肠上皮损伤重建立模型测定细胞损伤后迁移;通过免疫组化检测TGFβ的表达。结果:嘌呤核苷酸AMP和GMP分别在30(mol/L和150(mol/L及以上能显著抑制IEC-6细胞的增殖并表现浓度依赖,嘧啶核苷酸CMP仅在极高浓度(1440(mol/L)时对细胞增殖有一定的抑制作用,UMP和核苷酸混合物在受试浓度范围内未见明显作用,但是,CMP和UMP能解除嘌呤核苷酸AMP和GMP对细胞增殖的抑制。180(mol/L核苷酸混合物能促进细胞损伤后迁移,但不诱导TGFβ的表达。结论:嘌呤核苷酸抑制肠上皮细胞增殖,而嘧啶核苷酸能解除嘌呤核苷酸的抑制作用。核苷酸混合物能通过非TGFβ依赖的途径促进肠上皮细胞的损伤后迁移。关键词:外源核苷酸;IEC-6;增殖;迁移中图分类号:R574;Q59113;Q524文献标识码:A作为机体的一道天然屏障,肠上皮结构和功能的完整性对于维持正常的生命活动具有极为重要的意义。肠上皮通过隐窝细胞的增殖和向绒毛端的迁移补偿脱落的肠上皮细胞,维持肠上皮细胞的数量平衡和快速更新。另一方面,当肠上皮因各种因素受到损伤时(如炎症性肠病、溃疡、感染、辐射和化疗等),肠上皮可通过肠上皮细胞从邻近区域向损伤区域的迁移和细胞增殖进行损伤修复和上皮重建。因此,肠上皮细胞的增殖和迁移的调节对于维持肠上皮完整性具有重要作用。核苷酸是食物和母乳的正常成分,但其营养学和生理学意义不清楚。肠上皮是食物核苷酸吸收和代谢的场所,也可能是核苷酸发挥生理作用的关键部位。本研究通过体外培养的正常大鼠空肠上皮细胞株IEC-6研究外源核苷酸对增殖和迁移的影响,为正确认识和利用食物核苷酸的生理功能提供科学依据。1材料和方法111材料正常大鼠空肠上皮细胞株IEC-6由美国波士顿麻省总医院获得。DMEM培养基、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶购自Gibco;透析胎牛血清(dialyzedFBS)购自Hyclone;腺苷一磷酸(AMP)、鸟苷一磷酸(GMP)、胞苷一磷酸(CMP)、尿苷一磷酸(UMP)、噻唑蓝(MTT)均为Sigma产品。核苷酸混合物(NM)由AMP、GMP、UMP和CMP按摩尔比1:1:113:3混合配制而成。免疫组化试剂购自博士德。112方法11211细胞培养DMEM按说明配制,每升培养液加新生小牛血清10%,Hepes10mmol,L-谷氨酰胺2mmol,青霉素105U,链霉素100mg,IEC-6细胞在该培养液中,于37℃、10%CO2培养箱中培养,胰酶消化传代。11212MTT法测细胞增殖96孔板培养的细胞每孔加入5g/L的MTT溶液10(l,24孔板培养的细胞每孔加入5g/L的MTT溶液40(l,37℃、10%CO2培养箱中继续培养4小时,吸出培养液,96孔板每孔加入100(l二甲亚砜,24孔板每孔加入300(l二甲亚砜,轻轻震荡,待蓝色结晶完全溶解后,96孔板直接在酶联免疫检测仪上测定492nm处各孔的光密度值,24孔板则将二甲亚砜溶解液转移至酶标板上再在酶联免疫检测仪上测定。活细胞的线粒体在代谢过程中与MTT作用生成有色物质,故可用光密度值反映活细胞数量。11213浓度2效应试验消化的IEC-6细胞用DMEM培养液(含10%小牛血清)制成细胞悬液(4×104个/ml),加入96孔板,每孔200μl,培养过夜。次日吸出培养液,用无血清DMEM洗涤2次后加入含核苷酸受试物和2%透析胎牛血清的DMEM培养液,继续培养48小时后MTT法测定细胞增殖。受试物四种单核苷酸(AMP、GMP、CMP、UMP)和核苷酸混合物(NM)参照母乳中相应核苷酸的含量设4个浓度组,浓度从低到高依次为低浓度组、母乳浓度组、高浓度组...