第1页NK细胞制备与培养标准操作流程1目的与范围：1.1目的：规范NK细胞培养操作流程，保证NK细胞产品制备的稳定性、均一性。1.2范围：适用于本实验室细胞培养技术人员对NK细胞培养的全过程。2文件：2.1NK细胞制备与培养标准操作流程3记录：3.1NK细胞制备与培养记录表、操作1间清场记录表4试剂、耗材与仪器设备：4.1试剂：75%酒精、D-PBS缓冲液或生理盐水、淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、自体血清、A/B/C/D/E因子、IL-2。4.2耗材：T175培养瓶、1.5L培养袋、15ml离心管、50ml离心管、50ml一次性注射器、5ml一次性注射器、1ml一次性注射器、10ml移液管、1ml枪头、200ul枪头、10ul枪头、巴斯德滴管、0.2mlEp管、0.22um—次性过滤器。4.3仪器设备：超净工作台、离心机、倒置显微镜、CO2培养箱、第2页水浴锅、电动移液枪、1ml手动移液枪、200ul手动移液枪、医用剪刀、医用止血钳、试管架、50ml注射器支架、托盘。5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1洁净区需经紫外线照射，连续照射时间$30min,实验室共作过程中风机始终保持开启运行状态。5.1.2超净工作台需经过开机紫外线照射，照射时间$30min,开机风机运行$10min。开启超净工作台玻璃防护窗，待超净工作台内部气流稳定后才可使用。5.1.3将实验室所需的器械、耗材放于物料传递窗进行紫外线照射$30min（器械与各规格的移液枪头必须经过高温高压灭菌锅消毒灭菌，且在合格期内），照射完毕后将器械包与所需耗材用75%酒精纱布擦拭外包装消毒后放入超净工作台内备用。5.1.4将淋巴细胞分离液、AMMS无血清培养基、PBS缓冲液或生理盐水提前30min从4°C冰箱取出，用75%酒精纱布擦拭后放入超净工作台，恢复至室温备用。5.1.5A/B/C/D/E因子、IL-2在使用时提前10min从-20C冰箱取出，即用即取，禁止在常温状态下长期放置。5.1.6将所需T175培养瓶、50ml离心管、15ml离心管、50ml一次性注射器、10ml移液管、1ml移液枪头、200ul移液枪第3页头经过酒精擦拭后放入超净工作台备用。5.2试剂配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。5.2.2NK细胞培养基配制：5.2.2.1完全培养基：AMMS无血清培养基+5%自体血清5.222活化培养基：AMMS无血清培养基+IL-2（终浓度为1000IU/ml）5.2.3细胞因子配制：将因子B/C/D/E从4°C冰箱取出，打开后,用1ml移液枪注入1ml活化培养基使其充分溶解后吸出备用，再用1ml培养基冲洗西林瓶，以减少最大损耗。5.3T175培养瓶包被预处理（第-1天）5.3.1用移液枪将NK试剂A全部转移到事先备有的装有12.5mlD-PBS的15mL离心管中，充分混匀30s-1min后将溶液全部转移入T175培养瓶中，轻轻摇晃使其均匀铺满底部，4C冰箱平放过夜。（注意：第一次吸取试剂A原液后，可再用适量PBS冲洗西林瓶洗出残留原液，以最大程度减少损耗）5.3.224h后取出，直接吸弃包被液，无需清洗即可使用。6分离提取PBMC（第0天）：6.1制备血浆：6.1.1将装有全血的采血管用酒精擦拭外表面消毒后放入超净工作台第4页内，打开采血管盖子，将全血倒入至事先备好的50ml离心管中，一共2支，每管25ml。6.1.2室温2000rpm，离心10min（离心机升降速：升9降4）。6.1.3离心完毕后，从离心机中拿出离心管，用75%酒精纱布擦拭离心管外表面消毒，放入超净工作台内，用电动移液枪吸取上层血清至50ml离心管中，灭活（56°C水浴锅中水浴30min,4C放置30min），剩余下层血细胞备用。6.1.4将灭活好的血清2800rpm离心8min,离心完毕后，将上清分于3支15ml离心管中，-20C冰箱保存。6.2提取PBMC：6.2.1将生理盐水袋用75%酒精纱布擦拭消毒后放入超净工作台内，再用75%酒精纱布对生理盐水袋口进行擦拭消毒后，用医用剪刀剪去袋口。6.2.2用生理盐水对6.1.3剩余的下层血细胞进行稀释，稀释比例按生理盐水:血细胞=1.5:1，最后将稀释好的血细胞重悬、混匀备用。6.2.3根据稀释后的血细胞体积，在另一个50ml离心管加入对应体积的淋巴细胞分离液，将稀释、混匀的血细胞悬液缓慢加入到装有淋巴细胞细胞分离液的50ml离心管中（即淋巴细胞分离液:稀释的血细胞悬液=1:1）。6.2.3.1操作方法：可将离心管倾斜45°，用电动移液枪吸取血细胞第5页悬...
