分子生物学常用技术下VIP免费

分子生物学常用技术NCBI/Blast/Nucleotideblast1.核酸的分离纯化和鉴定:基因组DNA、总RNA、质粒2.基因的克隆与鉴定方法待查序列3.外源基因转移技术和表达体系4.检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE分子杂交:SB、NB、WB、基因芯片技术DNA序列测定生物信息学分析技术5.基因功能研究的方法6.组学研究技术：基因组学、蛋白质组学三、外源基因转移技术和表达体系1.外源基因转入技术细菌：热激法，电转化热激法转化试剂配制：？LB培养液LB-Amp平板LB-Kan平板a.加入连接产物/质粒，冰浴b.4290sec℃，冰浴c.培养：LB培养液d.涂板生物学方法：农杆菌介导的基因转导花粉管通道法介导的基因转化体外包装转染法共转化生殖细胞浸泡法介导的基因转化化学方法：PEG介导的基因转化磷酸钙沉淀法真核细胞生物化学方法：脂质体法：Kit生物物理方法：胚胎干细胞法电转化法：电转仪物理学方法：基因枪法显微注射介导基因转化胚囊、子房注射法介导基因转化激光微束介导基因转化超声波介导基因转化碳化硅纤维介导法2.原核细胞表达体系：大肠杆菌优点：遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强和适用范围广。缺点：表达的蛋白质产物不能进行翻译后修饰、高表达时容易发生折叠错误、Ecoli本身内毒素和毒性蛋白可能混杂在终产物中。成功例子：β-干扰素组成启动子：lac、trp、tac、PL启动子目的基因编码序列终止子：受体细胞表达载体表达方式非融合蛋白：pBV220融合蛋白分泌表达:含有信号肽序列，OmpA等带纯化标签的表达：GST、His6表面呈现表达带伴侣的表达：GroEL、GroES等分离纯化：亲和层析重组蛋白的制备：细菌重组表达载体Ni-亲和胶GST-亲和胶表达形式分析：可溶性/包涵体亲和纯化宿主菌:BL21转化重组蛋白表达：SDS-PAGE诱导剂重组蛋白WB鉴定3.真核细胞表达体系(1)酵母表达体系毕赤酵母表达体系：表达水平高(外源蛋白占菌体总蛋白10-30%)，异源蛋白的表达有胞内和分泌两种形式。工艺成熟，分离纯化简单，糖基化方式更接近高等生物。成功例子：乙型肝炎病毒表面抗原酿酒酵母表达体系：遗传背景清楚，容易操作，但表达的重组蛋白产量偏低(外源蛋白占菌体总蛋白10%)，且会被超糖基化。有胞内表达和分泌性表达两种，只有分泌性表达的蛋白质才能被糖基化。成功例子：水蛭素(2)昆虫细胞杆状病毒表达体系杆状病毒主要感染昆虫，利用昆虫细胞生产重组蛋白。受体细胞：草地夜蛾细胞株sf9和sf21。优点：昆虫和哺乳动物细胞的翻译后加工方式相似，重组蛋白的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白相似，表达水平较高(发酵液中目的产物含量1-500mg/L)。缺点：糖基化程度较低，形式较为单一。(3)哺乳动物细胞表达体系调控序列启动子：SV40、RSV、ADV、CMV、HSP、MCK终止子：SV40小t抗原基因、β珠蛋白基因、牛生长激素基因的转录终止信号。选择性标记基因：TK、APH、dhfr、XGPRT可调控表达体系：Tet-on和Tet-off体系pERV3和pEGSH诱导体系宿主细胞：CHO、COS、BHK、SP2/0、NIH3T3、HEK293等优点：产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近，糖基化等翻译后加工最准确。缺点：表达水平低，发酵液中目的产物我国为0.2~1g/L，国际上多在1~2g/L以上。2007年，全球销售额最高的6大类生物技术药物中，有五类(肿瘤治疗药物、anti-TNFα药物、EPO、胰岛素和凝血因子)都是经哺乳动物细胞表达生产的。动物细胞大规模培养是当前生物药物生产的主流方式。四、检测方法1.电泳技术核酸：完整性、分离、纯化琼脂糖凝胶电泳：agarose,水平,1XTAEEB(2ng),Gelred,Goldview,紫外灯试剂配制：？50XTAE图PCR产物电泳结果1.DNA相对分子质量DL2000;2.PCR产物;3.PCR空白对照。聚丙烯酰胺凝胶电泳:PAGE(Acr+Bis)垂直，银盐染色非变性/变性蛋白质：SDS-PAGE1.试剂配制：？30%丙烯酰胺-N,N亚甲双丙烯酰胺1.5MpH8.8Tris-HCl1MpH6.8Tris-HCl10%SDS10%过硫酸铵电泳缓冲液：25mMTris-HCl(pH8.0),250mMGly,0.1%SDS(pH8.3)4X电泳加样缓冲液考马斯亮蓝染色液脱色液2.浓缩胶和分离胶配制表：？10%分离胶1.配胶：分离胶浓度，胶凝时间，储存2.上样：30μl/次/道3.电泳：90V---120V4.染色5.脱色步骤：1948...