菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立VIP免费

园艺学报2014，41（6）：1257–1266http://www.ahs.ac.cnActaHorticulturaeSinicaE-mail:yuanyixuebao@126.com收稿日期：2014–01–27；修回日期：2014–03–27基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203021）；海南省重大科技项目（ZDZX2013020-3）；海南省科学事业费项目（琼财预[2013]131号）；海南省重点科技计划应用研究及产业化项目（ZDXM20130031）*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：hefanhn@163.com）菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立胡加谊1,2，罗志文2，范鸿雁2，李向宏2，刘志昕3，何凡2,*（1海南大学环境与植物保护学院，海口570228；2海南省农业科学院热带果树研究所，农业部海口热带果树科学观测实验站，海口571100；3中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口571101）摘要：菠萝凋萎相关病毒（Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-2，PMWaV-2）是引起的菠萝凋萎病（Mealybugwiltofpineapple，MWP）的重要病原。本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计特异性引物和探针，建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。该方法能高灵敏检测出阳性样品，对阴性样品及空白对照均无荧光反应；灵敏度比普通PCR高100倍；重复性试验表明批内和批间变异系数均在1.85%以内，表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2定量检测方法。关键词：菠萝；菠萝凋萎病毒–2（PMWaV-2）；TaqMan探针；实时荧光定量RT-PCR；检测中图分类号：S668.3；S432文献标志码：A文章编号：0513-353X（2014）06-1257-10DevelopmentofaReal-timeFluorescentQuantitativeRT-PCRMethodfortheDetectionofPineapplemealybugwiltassociatedvirus-2HUJia-yi1,2，LUOZhi-wen2，FANHong-yan2，LIXiang-hong2，LIUZhi-xin3，andHEFan2,*（1CollegeofEnvironmentandPlantProtection，HainanUniversity，Haikou570228，China；2InstituteofTropicalFruitTrees，HainanAcademyofAgriculturalSciences/HaikouInvestigationStationofTropicalFruitTrees，MinistryofAgriculture，Haikou571100，China；3InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology，ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences，Haikou571101，China）Abstract：Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-2（PMWaV-2）isanimportantpathogenthatcausesMealybugwiltofpineapple（MWP）.Thisstudyestablishedareal-timequantitativeRT-PCRmethodwithTaqManprobebasedonspecificprimersofconservednucleotidesequenceofPMWaV-2coatproteingene.Theresultsshowedthatthemethodishighlysensitivetopositivesample，buthasnofluorescencesignaltohealthsampleandwatercontrol.Thesensitivityofreal-timequantitativeRT-PCRisabout100timeshigherthanregularPCR.Three-timerepeatsrevealedthatthecoefficientsofvariationbetweentheintra-andinter-assaywerebothwithin1.85%，indicatingasimple，specificity，highsensitivity，andreliablereproducibilitydetectionmethodtoPMWaV-2.Keywords：pineapple；PMWaV-2；TaqManprobe；real-timequantitativeRT-PCR；detction1258园艺学报41卷菠萝凋萎病（Mealybugwiltofpineapplewilt，MWP）是世界各菠萝主产区的重要病害之一，对经济栽培造成严重影响（Carter，1934，1942，1945）。菠萝凋萎病的发生被认为是菠萝凋萎病毒（Pineapplemealybugwiltassociatedvirus）和粉蚧共同危害的结果，全世界已报道了5种菠萝凋萎病毒，即PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3、PMWaV-4和PMWaV-5（Gambleyetal.，2008）和两种传毒粉蚧，即菠萝洁白粉蚧（Dysmicoccusbrevipes）和新菠萝灰粉蚧（D.neobrevipes）。目前，在中国已见报道的菠萝凋萎病毒有PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3（吴丽亭等，2009，2010；李运合等，2010）。夏威夷大学的学者经研究首次提出PMWaV-2为菠萝凋萎病的重要病原之一（Setheretal.，1998，Sether&Hu，2002）。国内有学者报道，PMWaV-2和菠萝粉蚧共同作用是引起菠萝凋萎病的最重要原因，其发病率可高达60%，可造成25%~30%的经济...