专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段知识点VIP免费

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段一、细胞内DNA复制1、细胞内DNA复制条件分析（1）模板：DNA母链（2）原料：四种脱氧核苷酸（3）能量：ATP（4）酶：解旋酶、DNA聚合酶（5）引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。2、细胞内DNA复制过程（1）DNA的反向平行结构：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。（2）DNA的复制过程:解旋、引物结合、子链合成。边解旋边复制。DNA分子能准确复制的原因：DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对原则。解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键。二、PCR扩增的原理及条件1、PCR原理：（1）在80～100℃时，DNA双螺旋结构将解体，，双链分开，这个过程称为变性。（2）当温度缓慢降低时，两条彼此分离的DNA链重新结合形成双链，称为复性（退火）。（3）PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。2、复制条件：缓冲溶液，DNA模板，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，两种引物，控制温度。3、PCR的反应过程预变性：在循环之前，常要进行一次预变性以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。复性：50℃左右时，引物与单链DNA结合。延伸：在72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。4、PCR技术与体内DNA复制的比较不同点：（1）解旋（2）特点（3）TaqDNA聚合酶（4）循环次数（5）温度（6）引物相同点：（1）模板（2）原料（3）能量（4）子链延伸方向三、实验操作1、PCR反应体系：（P62）10倍浓缩的扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸的等量混合液、引物Ⅰ、引物Ⅱ、TaqDNA聚合酶、模板DNA、水2、实验操作步骤（1）准备好PCR反应体系的配方（2）用微量移液器按配方在往微量离心管中加入各组分（3）盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液（4）离心10S（5）将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。四、操作提示（1）避免外源DNA污染：所用微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水等使用前高压灭菌。（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。（3）添加反应成分时，每吸取一种试剂后都要更换一个移液器的枪头。所有成分都加入后，盖严离心管口的盖子，防止实验中脱落或液体外溢。用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，离心处理约10s，使反应液集中在离心管底部，在放入PCR仪中进行反应。五、结果分析与评价1、原理：DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。2、DNA含量的测定：稀释→对照调零→测定→计算（1）稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；（2）对照调零：以蒸馏水作为空白对照，将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。（3）加入步骤1中的DNA稀释液100µL至比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。（4）计算：DNA含量＝50﹡×（260nm的读数）×稀释倍数公式中50的含义：在标准厚度为1cm比色杯中，OD260为1相当于50µg/mＬ的双链DNA。