精选精选20212021版课件版课件11变性与变性与复性复性PCRPCR原理原理精选精选20212021版课件版课件22DNADNA的变性的变性(denaturation)(denaturation)：：在某些理化因素作用下，在某些理化因素作用下，DNADNA分子内碱基对之间的氢键断分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过不规则无序的单链线团样结构的过程。程。精选精选20212021版课件版课件33精选精选20212021版课件版课件44解链温度（融解温度，解链温度（融解温度，TmTm））(meltingtemperature)(meltingtemperature)：：使使50%50%的的DNADNA发生变性发生变性时的环境温度。时的环境温度。DNADNA的变性从开始解链到的变性从开始解链到完全解链是在一个相当窄的温度内完全解链是在一个相当窄的温度内完成的。完成的。精选精选20212021版课件版课件55精选精选20212021版课件版课件66增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。精选精选20212021版课件版课件77DNADNA的复性的复性（（renaturation)renaturation)：：在适当条件下，变性在适当条件下，变性DNADNA的两条互补链可再恢复成天然的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。精选精选20212021版课件版课件88精选精选20212021版课件版课件99减色效应：变性DNA复性后对260nm紫外光吸收减少的现象。精选精选20212021版课件版课件10101.常用的变性方法：①热变性②酸碱变性③化学试剂变性精选精选20212021版课件版课件11112.2.影响复性的因素影响复性的因素①①序列简单的分子复性快，如序列简单的分子复性快，如poly(dT)poly(dT)和和poly(dA)poly(dA)识别快识别快②②DNADNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③③离子强度↑→有利于复性离子强度↑→有利于复性④④DNADNA浓度↑→复性↑浓度↑→复性↑Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③Tm=81.5+16.6lgM+0.41℃（G+C）%-500/n-0.61×（甲酰胺%）精选2021版课件12PCR技术总论东胜创新东胜创新www.eastwin.com.cnwww.eastwin.com.cn聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。东胜创新东胜创新www.eastwin.com.cnwww.eastwin.com.cn聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称TaqDNA聚合酶。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。东胜创新东胜创新www.eastwin.com.cnwww.eastwin.com.cnPCR基本原理PCR基本原理PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。。精选2021版课件16PCR原理Sampl...
