WB灰度值测定VIP免费

ImageJ测到了WB条带灰度值关于用ImageJ量化westernblot条带灰度值,在网上一直盛传着两种操作方法，然鹅~小伙伴们却一直不确定到底哪种才是正确的测量灰度方法，甚至将灰度与光密度弄混淆。今天咱们一起就这个机会学习下,请先看看你是用以下那种方法测量灰度值？以下是两种方法的具体操作。方法一：1、打开ImageJ软件-左上角file-Open选择自己的条带图片（事先把条带摆正）2、把图片转化成灰度图片：Image—type—8-bit3、第一个矩形工具-选上所有条带4、analyze—Gels—selectfirstlane-Gels-plotlanes（在这第四步也可以分开选取,如：框选第一个条带—analyze—Gels—selectfirstlane—将第一个框拖移到余下条带—Gels—selectnextlane）5、选中直线工具,将开口波峰关闭6、选中魔棒工具（正数第七个），点击波峰,就得出所有area值。A小W实uncalii3r«iMi方法二7534.S1S26^3^.241打开ImageJ软件—左上角file—Open选择自己的条带图片（事先条带弄正）2、把图片转化成灰度图片：Image—type—8-bit3、扣除背景：Process—SubtractBackground—50pixels并勾选LightBackground5、设定参数:Analyze—setmeasurement—勾选Area、Meangrayvalue、Min&maxgrayvalue、Integrateddensity6、Analyze—setscale—unitoflength选项里改为pixels，确定匚licktoRemoveScaleGlobalScale:300pixels/inchHelpCancelOKk』6、图像分割。Edit-Invert-选中椭圆圈（手残党首选）/不规则圆圈（心灵手7、Analyze—Measurement即得到Intden,重复6、7步就得到所有Intden值•ResultsAreaMeanMinMaxInlDenR^wlfitOen10.00973,7901313S0,64157704小伙伴们，你们是哪种方法呢？首先先把结论说出来,其实两者得出的area和Intden严格来说都不是灰度值,前者是面积而后者是光密度值，但用来量化WB条带都是OK的。ImageJ这个软件在将westernblot条带量化时存在两种参数：灰度与光密度（假，暂且这么称呼，原因下文再说），这两者在理解使用ImageJ量化WB条带十分重要，请务必仔细看以下几个概念。SetScale巧党义无反顾），手动圈上单个条带'…|m包日"O」I=LIHu|匸|^；|二］七|7小7扁I上M—<11v~1-^19C35B).■丑1、灰度（gray）:是指图像中各种颜色的深浅程度，它以整数值表示，一般的图像分析软件将图像每个像素点的颜色分为0-255共256级，每一像素点对应的数值即灰度，灰度值越小物体颜色越深。有兴趣的小伙伴，可以随意用ImageJ打开一张图片，光标在图片上任意移动，得到的value值最小为0（纯黑），最大为255（纯白）。2、光密度（OD，真）:也就是吸光度（A）,光线通过溶液或某一物质前的入射光强度Io与该光线通过溶液或物质后的出射光强度Ib比值的对数OD=lg（Io/Ib），其实就是大家熟悉的分光光度法的朗伯比尔定律。明确这两个概念后，我们再来看为什么称ImageJ里的光密度是“假”，因为在图像分析中的光密度（假）是由灰度值再经计算得到的，它是一个相对值，但其算法与OD值的算法类似。只是它的入射光强度由Westernblot胶片上最亮区域的平均灰度值代替，而出射光强度则由待测目标平均灰度值代替。即:图像分析系统的光密度值=lg（WB胶片上最亮区域的平均灰度值/待测目标的平均灰度值），再简单点来说,就是光密度（假）和正儿八经的灰度值有血缘关系。总结起来说灰度与光密度（假）都能用来量化westernblot条带，两种量化任君随意挑。现在说回两种操作方法：方法一：是通过每个条带上众多像素点对应的灰度值勾画出一条曲线，最后魔棒点出算出的area值其实就是该条带所对应的面积大小。条带越大，area值越大。方法二：是通过上文说到的光密度（假）计算方法得出来的，最后得出的Intden值是所圈面积下的总光密度值，再除以圈下面积area，得出的是平均光密度值（图像中阳性区域每一像素点的OD值叠加后除以测量的面积）。条带（颜色反转后）越白越亮则Intden/area越大。所以严格意义上来说，方法一方法二最后得出的数据都不属于正儿八经的灰度值，但又与灰度值有着千丝万缕的联系。如果只是量化WB条带，两种方法是都能选用的，记得标注你得到的结果是area还是Intden，但如果你想测出真正的灰度值，那么我们下节课再来好好谈...