实验三、小鼠骨髓染色体制备与观察VIP免费

实验三、小鼠骨髓染色体标本的制备及观察李孝敬基础医学楼A412生科院办公室电话：15690799899一、实验目的•初步掌握（小鼠）骨髓细胞染色体标本的制备原理和方法•巩固显微镜的操作技术•了解小鼠的染色体形态特征二、实验原理染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。染色体异常也称染色体发育不全。目前已确认染色体病综合征100余种，智力低下和生长发育迟滞是染色体病的共同特征。21三体综合征；18三体综合征、猫叫综合征18三体综合征二、实验原理染色体标本的观察广泛应用于一些疾病的临床诊断中。例如白血病、恶性血液病等的诊断。染色体是染色质在细胞分裂期的存在形式。细胞分裂的中期，染色体在赤道板上排列清晰，是染色体观察的最佳时期。骨髓细胞数量多且分裂旺盛，可直接进行染色体标本的制备。取材方便，操作简单和无需无菌培养，是研究小型哺乳动物等染色体的常用方法。人骨髓染色体抽取怎样才能制备一个好的染色体标本？获得大量处于有丝分裂中期的细胞。使细胞膜破裂，且染色体能够完整并较分散的释放出来。秋水仙素处理：秋水仙素溶液可抑制纺锤体的形成，使正在分裂的骨髓细胞停止在细胞分裂中期，积累大量中期分裂相细胞。低渗作用:使细胞充分膨胀，减少染色体间的相互缠绕和重叠。预固定：终止低渗作用，使细胞离心时不易破裂，固定维持细胞形态结构。高距离滴片：使细胞膜易于破裂，获得中期染色体标本，在显微镜下观察染色体的结构和数量。三、实验器材和试剂•1.器材蜡盘、手术剪、小镊子、平皿、注射器、10ml离心管、吸管、量筒、预冷载玻片、试管架、离心机、恒温水浴锅、显微镜、乙醚酒精、擦镜纸•2、试剂100ug秋水仙素液、0.075mol/LKCl低渗液、Giemsa染液1.秋水仙素处理：选择体重20g左右的小白鼠，按2~4ug/g(小鼠)秋水仙素，与处死前4h，对其进行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。四、实验步骤注意：剪去少量骨质，避免骨髓细胞丢失；擦净血迹和肌肉细胞以免影响观察；用0.075mol/LKCl收集足量细胞，反复冲洗直到股骨发白。2.取材：颈椎脱臼法处死取两后肢股骨纱布擦净肌肉剪去股骨两头，暴露骨髓腔低渗液(5ml)冲洗至离心管内收集骨髓细胞颈椎脱臼法处死小鼠3.低渗：用吸管吹打骨髓细胞使其分散，加入预温37℃的低渗液至8ml,将离心管至37℃水浴锅中，保温至少30min后取出，使细胞充分吸水膨胀。低渗不足，则细胞膨胀不够，滴片时细胞不破裂。低渗过度，则细胞提前破裂，染色体观察不全。空气吹打法：用吸管橡胶头内的空气混匀液体。4.预固定：加1ml新配制固定液混匀1500r/min，5min弃上清液。固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需现配；离心需要配平。作用：终止低渗；维持细胞的膨胀状态；防止离心破裂5.固定、制细胞悬液：加固定液5ml吹打混匀固定15min离心1500r/min，5min弃上清，加固定液0.2~0.4ml吹打成细胞悬液，准备制片使用。制备细胞悬液时，根据具体情况加固定液，以悬液呈现乳白色为宜。6.滴片：冰片倾斜30°,细胞悬液距离玻片30cm高，在不重叠位置滴1～2滴，用口吹散细胞，过火焰干燥。注意：载玻片预冷、高度、吹散、不可使载玻片烫手。7.染色：在玻片上滴几滴Giemsa染液并铺匀，8～10min，倒去染液，晾干。（染色盘中进行）8.小鼠染色体观察：低倍镜、高倍镜下寻找染色体分散的中期分裂相.小鼠骨髓染色体10×10小鼠骨髓染色体10×40数目观察：小鼠2倍体细胞染色体，数目2n=40条。其中19对为常染色体，一对为性染色体，染色体的核型分为4组。雄性XY,雌性XX,Y染色体最小。形态特征观察：端着丝粒染色体“U”“V”。五、注意事项1．掌握好秋水仙素的浓度和处理时间；2．离心前需要配平；3.小鼠骨髓要冲洗干净，以收集足够的骨髓细胞；3．低渗处理是实验成败的关键，注意低渗时间；4．固定液要现配现用，固定要充分；5．载玻片要洁净并预冷，滴片要有一定的高度；6.细胞悬液不能太稀，要呈乳白色；7.烤片时温度不能太高。8.冲洗染液时水流要缓慢，以免细胞流失过多。六、作业1.简述小鼠染色体制备的流程。2、绘制显微镜下观察到的小鼠染色体图像。3、如看不到染色体，请分析失败原因。