Western免疫印迹常见问题解答-赛信通（上海）生物试VIP免费

Western 免疫印迹方法做 Western 免疫印迹时，将膜孵育在稀释的抗体中轻轻摇动并 4°C 过夜。抗体稀释在含 5% 的 w/v BSA 或 1X TBS, 0.1% Tween-20 的脱脂奶粉当中。注意：参考一抗的产品说明书选用合适的抗体稀释液和稀释比例。A．所需溶液和试剂注意：所有溶液用 Milli-Q 或相当级别的水配制。1. 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS): (#9808) 配制 1L 1X PBS 时，取 50ml 20X PBS 用 950ml RODI 水稀释到 1L，混匀。2. 1X SDS 上样缓冲液： (#7722, #7723) 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 ，25°C), 2% w/v SDS, 10% 甘油, 50 mM DTT, 0.01% w/v 溴酚蓝或酚红。3. 转膜缓冲液：25 mM Tris 碱, 0.2 M 甘氨酸, 20% 甲醇 (pH 8.5)。4. 10X Tris 缓冲盐水(TBS): 配制 1L 时，称取 24.2g Tris 碱，80g NaCl 加入 1L 水中；调整 pH 为 7.6（稀释至 1X 使用）。5. 脱脂牛奶: (#9999) (重量体积比 [w/v])6. 封闭液：含 5% w/v 脱脂奶粉，0.1% Tween-20 的 1X TBS。配 150ml 时，在 135ml 水中兑入 15ml 10X TBS ， 混 匀 ； 加 入 7.5g 脱 脂 奶 粉 ， 使 之 溶 解 ； 边 搅 拌 边 加 入 0.15 ml Tween-20 (100%)，混匀。7. 洗液: 1X TBS, 0.1% Tween-20 (TBS/T)。8. 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA): (#9998). 9. 一抗稀释液：含 5% w/v 脱脂奶粉或 BSA，0.1% Tween-20 的 1X TBS。配 20ml 时，在 18ml 水中兑入2ml 10X TBS，混匀；加入 1gBSA 或脱脂奶粉，使之溶解；边搅拌边加入 20 μl Tween-20 (100%)，混匀。10. Phototope®-辣根过氧化物酶 Western 印迹检测体系：(抗兔 #7071)(抗鼠#7072)试剂盒中包括生物素标记蛋白分子量标准品(#7727)，标记有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)的二抗(抗兔 #7074)( 抗鼠 #7076)，抗生物素HRP 偶联抗体(#7075)，LumiGLO®化学发光试剂盒(#7003)。11. 预染蛋白分子量标准品，宽谱（预混型: (#7720)。12. 印迹膜：本套方法在硝酸纤维素膜上优化过，CST 推荐使用硝酸纤维素膜。PVDF 也可以用本方法。B．蛋白印迹样品制备的通用方法如下所述：1. 刺激细胞：加入含调节因子的新鲜培养基处理一定的时间。2. 吸去培养基。用 PBS 清洗一次，吸去洗液。3. 加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞(6 孔板中每孔加 100...