PCR技术的种类及其应用VIP免费

PCR 技术的种类及其应用 1 PCR 技 术 的 基 本 原 理 PCR 技 术 是 在 模 板 DNA、 引 物 和 四 种 dNTP等 存 在 的 条 件 下 , 依 赖 于 DNA聚 合 酶 (T aq 酶 )的 酶 促 合 成 反 应 。 其 具 体 反 应 分 三 步 ：变 性 、 退 火 、 聚 合 。 以 上 三 步 为 一 个循 环 ， 每 一 循 环 的 产 物 DNA又 可 以 作 为 下 一 个 循 环 模 板 ，数 小 时 后 ，介 于 两 个 引物 之 间 的 目 的 DNA得 到 了 大 量 的 复 制 ，经 25～ 30次 循 环 DNA数 量 可 达 2×106～ 7拷 贝 数 。 2 PCR技 术 的 种 类 2.1 反 向 PCR( Inverse PCR, IPCR)技 术 原 理 ： 反 向 PCR是 克 隆 已 知 序 列 旁 侧 序 列 的 一 种 方 法 ． 主 要 原 理 是 用 一 种 在 已 知 序 列中 无 切 点 的 限 制 性 内 切 酶 消 化 基 因 组 I)NA． 后 酶 切 片 段 自 身 环 化 ． 以 环 化 的 DNA作 为 模 板 ， 用 一 对 与 已 知 序 列 两 端 特 异 性 结 合 的 引 物 ， 扩 增 夹 在 中 间 的 未 知 序 列 。该 扩 增 产 物 是 线 性 的 DNA片 段 ， 大 小 取 决 于 上 述 限 制 性 内 切 酶 在 已 知 基 闲 侧 翼 DNA序 列 内 部 的 酶 切 位 点 分 布情况。 用 不同的 限 制 性 内 切 酶 消 化 ， 可 以 得 到 大 小 不同的模 板 DNA， 再通过反 向 PCR获得 未 知 片 段 。 该 方 法 的 不足是 ： ①需要 从许多酶 中 选择限 制 酶 ， 或者说必须选择一 种 合 适的酶 进行酶 切 才能得 到 合 理 大 小 的 DNA片 段 。 这种 选择不能在 非酶 切 位 点 切 断靶DNA。 ②大 多数 有 核 基 因 组 含 有 大 量 中 度 和 高 度 重 复 序 列 ， 而 在 YAC或Cosmid中 的 未 知 功 能序 列 中 有 时 也 会 有 这些 序 列 ， 这样 ， 通过反 向 PCR得 到 的 探 针 就有 可 能与 多个 基 因 序 列 杂 交 。 2.2 锚 定 PCR(Anchored PCR, APCR)技 术 用 酶 法 在 一 通用 引 物 反 转 录 cDNA3’-末 端 加 上 一 段...