mRNAmRNA的提取及分的提取及分离纯化方法离纯化方法mRNAmRNA的提取及分的提取及分离纯化方法离纯化方法生物化工卢余盛生物化工卢余盛主要内容一、mRNA的结构特征及生理功能二、体外分离提取mRNA的意义三、总RNA分离的分离提取四、mRNA的分离纯化五、结果分析mRNA的结构特征及生理功能•mRNA是在细胞核中形成后转移到细胞质中，将从DNA分子上转录的遗传信息带到核糖体上，作为合成蛋白质的指令，故称信使RNA。•mRNA占细胞RNA总量的1％～5％。mRNA种类很多，哺乳类动物细胞总计有几万种不同的mRNA。mRNA的分子大小变异非常大，小到几百个核苷酸，大到近2万个核苷酸，沉降系数在8s～30s之间。mRNA一般都不稳定，代谢活跃，更新迅速，寿命较短。•真核生物mRNA的结构很特殊，即5’-末端有帽子结构，3’-端绝大多数均带有多聚腺苷酸尾巴，其长度为20～200个腺苷酸。体外分离提取mRNA的意义•真核生物DNA的结构包括编码区和非编码区，而编码区是不连续的，又分为外显子和内含子，外显子能够转录mRNA,编码出蛋白质，而内含子则不可以。所以要想更深一步研究DNA在遗传表达以及控制生命活性中的作用，就必须弄清DNA控制蛋白质合成的有义序列即外显子序列。•从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增,即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段，模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。（一）、总RNA的提取1、TRIzol法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。TRIzol法提取流程1．样品处理：（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1mlTrizol，混匀，室温静置5min。（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1mlTrizol充分匀浆，室温静置５min。2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3．4℃离心，12000g×15min，取上清。4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。6．加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7.晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。试验流程图细胞基因组DNA水相有机相RNA氯仿纯化pH5.7离心加入裂解液(TRNzol-A+)细胞选择贴壁细胞悬浮细胞2、苯酚法细胞内大部分RNA均与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠（Sodiumdodecylsulfate,SDS）的缓冲液中，加等体积水饱和酚，通过剧裂振荡，然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相，被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相，或者在两相界面处形成凝胶层。苯酚法提取酵母RNA取1g活性干酵母在研钵中研碎，加10mLSDS-缓冲液使成匀浆，洗入各Ep管（略少于管容积的一半），加溶菌酶0.1mL，混匀，室温静置10min，再加等体积饱和酚液，室温下剧烈振荡5min。置冰浴中分层，在0-4℃低温环境下，10000r/min离心10min。吸出上层清液，转入新的Ep管，加等体积氯仿-异戊醇，室温下剧烈振荡2.5min，然后10000r/min离心5min。吸出上层清液，转入另一新Ep管，加2倍体积95％乙醇（含2％乙酸钾），在冰浴中放置30min，使RNA沉淀。再以10000r/min离心5min，弃上清液，沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速离心各1min，保留沉淀。倾去乙醚后，减压真空干燥，准确称重，记录。3、异硫氰酸胍—酚法异硫氰酸胍—酚法提取RNA的原理如下：GIT与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌...
