PCR反应原理及其操作1.PCR1.PCR的基本原理的基本原理2.PCR2.PCR反应体系反应体系3.PCR3.PCR的基本步骤的基本步骤PCRPCR的基本原理的基本原理•试管中进行的试管中进行的DNADNA复制反应，依据复制反应，依据①①DNADNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；②②体外体外DNADNA分子于不同温度下可分子于不同温度下可变性变性和复性和复性的性质；的性质；•通过人为控制体外合成系统的温度，通过人为控制体外合成系统的温度，使使①①双链双链DNADNA变成单链变成单链，，②②单链单链DNADNA与人工合成的与人工合成的引物退火引物退火，，③③DNADNA聚合酶使聚合酶使引物沿着单链模板延引物沿着单链模板延伸为双链伸为双链DNADNA。。PCRPCR反应体系反应体系•4种dNTP混合物各200umol/L•（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•引物各10～100pmol•模板DNA0.1～2ug•TaqDNA聚合酶2.5u•Mg2+1.5mmol/LPCRPCR的基本步骤的基本步骤1.DNA变性（90-96℃℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。2.退火（复性）（25-65℃℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75℃℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸在引物作用下，Taq酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端自3'端延伸的。实际上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。PCRPCR每一步的转换通过每一步的转换通过温度的改变温度的改变控制。控制。DNADNA模板解链（模板解链（变性变性）、引）、引物与模板结合（物与模板结合（退火退火）、）、DNADNA聚合聚合酶催化新生酶催化新生DNADNA的合成（的合成（延伸延伸）三）三个步骤构成个步骤构成PCRPCR反应的一个循环。反应的一个循环。此循环反复进行，可使目的此循环反复进行，可使目的DNADNA得得以迅速扩增。以迅速扩增。理论扩增率：理论扩增率：22nn递增递增（（nn为循环次为循环次数），数），2525～～3030循环，目标循环，目标DNADNA可可增加增加101099倍。倍。由于引物和底物的消耗，酶活力的由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式。由指数形式变为线性形式。以上“变性、退火、延伸”三部曲以上“变性、退火、延伸”三部曲为为PCRPCR一轮循环。一轮循环。PCRPCR扩增曲线扩增曲线
