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不对称PCR制作人:张天夫PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温(95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3’端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5’→3’方向延伸,合成DNA新链。这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。不对称PCR(asymmetricPCR)是用不等量的一对引物,PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50~1001.∶在PCR反应的最初10~15个循环中,其扩增产物主要是双链DNA,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量,需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增,制备双键DNA,(dsDNA),然后以此dsDNA为模板,再以其中的一条引物进行第二次PCR,制备ssDNA.应用:不对称PCR制备的ssDNA,主要用于核酸序列测定.尤为用cD-NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。不对称PCR(AsymmetricPCR)的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA(ss-DNA)。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物;其最佳比例一般为1:50~1:100,关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少,均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA(ds-DNA),再以ds-DNA为模板,只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开,而得到纯ss-DNA。全自动PCR仪:新发展:由Brandeis大学Wangh与他人合作发明的指数线性PCR(LATE-PCR)是一种新技术,属于不对称PCR的高级形式,在引物设计时进行革新,并且采用了一种改良的热循环,可以完成可靠的不对称放大。如果产生单链,在反应过程中就会累积下来,因此在退火期间,不需要探针就可以获得结果。采用分子信标(beacons),或者是AppliedBiosystems公司的TaqMan探针检测退火,因为探针温度必须高于引物的温度,因此,Wangh认为可以引入一种较低的温度检测步骤。方案之一是让热循环与退火步骤一样,但是要在限制性引物用尽之后或者是延伸步骤之后引入。另一方案是将退火温度与检测温度分开。LATE-PCR创造了一个用于检测的温度空间,在延伸期间,允许探针与一股单链靶子相结合,并且不需要干扰或降解就能使链断裂。在低温分子信标作用下,茎环变短,因此更容易识别等位基因。Wangh认为这是一个重大突破。LATE-PCR反应的Ct值依赖于目标基因组的原始数目,与对称PCR很相似。但是,不管你怎样开始操作,所有的LATE-PCR反应最终都会产生许多单链产物,不需要任何清除,直接将这些产物用于循环测序法,因此我们将之称为Dilute-N-Go测序。Wangh还开发了一系列的“Elixirs”试剂,这些试剂以一种独特方式与反应中的成分相互作用,以避免引物错配。他们是高性能DNA聚合酶HotStart的替代物,但与HotStart不同,HotStart只在零度及第一次热反应后存在,而Elixirs在整个反应过程中都存在。Elixirs与其他成分混合在一起,可以避免引物错配的情况发生;但是也会将分离开的基因组链清除掉。他们制止了引物二聚体的出现,改善了有若干成分的多路反应结构。目前,整个细胞生物学领域中所用的原材料正变得越来越小,尤其是PCR。这有许多优势,但在对称PCR中,则会带来许多问题。如果必须采用更多的循环达到Ct,引物错配及扩增的废物就会增加,这些不需要的产物会与目标扩增物相竞争,会破坏试验结果。在对称PCR中,需要花费大量的时间去优化反应,才能解决这个...

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