不对称PCRVIP免费

不对称PCR制作人：张天夫PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成：即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。不对称PCR(asymmetricPCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA).这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～1001.∶在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA.不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例.还有一种方法是先用等浓度的引物PCR扩增，制备双键DNA，(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA.应用：不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定.尤为用cD－NA经不对称PCR进行DNA序列分析是研究真核DNA外显子的好方法。不对称PCR（AsymmetricPCR）的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这两种引物分别称为限制性引物与非限制性引物；其最佳比例一般为1：50～1：100，关键是限制引物的绝对量。限制性引物太多太少，均不利于制备ss-DNA。也可用普通PCR制备靶DNA双链DNA（ds-DNA），再以ds-DNA为模板，只用其中一种过量引物进行单引物PCR制备ss-DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。全自动PCR仪:新发展：由Brandeis大学Wangh与他人合作发明的指数线性PCR（LATE-PCR）是一种新技术，属于不对称PCR的高级形式，在引物设计时进行革新，并且采用了一种改良的热循环，可以完成可靠的不对称放大。如果产生单链，在反应过程中就会累积下来，因此在退火期间，不需要探针就可以获得结果。采用分子信标（beacons），或者是AppliedBiosystems公司的TaqMan探针检测退火，因为探针温度必须高于引物的温度，因此，Wangh认为可以引入一种较低的温度检测步骤。方案之一是让热循环与退火步骤一样，但是要在限制性引物用尽之后或者是延伸步骤之后引入。另一方案是将退火温度与检测温度分开。LATE-PCR创造了一个用于检测的温度空间，在延伸期间，允许探针与一股单链靶子相结合，并且不需要干扰或降解就能使链断裂。在低温分子信标作用下，茎环变短，因此更容易识别等位基因。Wangh认为这是一个重大突破。LATE-PCR反应的Ct值依赖于目标基因组的原始数目，与对称PCR很相似。但是，不管你怎样开始操作，所有的LATE-PCR反应最终都会产生许多单链产物，不需要任何清除，直接将这些产物用于循环测序法，因此我们将之称为Dilute-N-Go测序。Wangh还开发了一系列的“Elixirs”试剂，这些试剂以一种独特方式与反应中的成分相互作用，以避免引物错配。他们是高性能DNA聚合酶HotStart的替代物，但与HotStart不同，HotStart只在零度及第一次热反应后存在，而Elixirs在整个反应过程中都存在。Elixirs与其他成分混合在一起，可以避免引物错配的情况发生；但是也会将分离开的基因组链清除掉。他们制止了引物二聚体的出现，改善了有若干成分的多路反应结构。目前，整个细胞生物学领域中所用的原材料正变得越来越小，尤其是PCR。这有许多优势，但在对称PCR中，则会带来许多问题。如果必须采用更多的循环达到Ct，引物错配及扩增的废物就会增加，这些不需要的产物会与目标扩增物相竞争，会破坏试验结果。在对称PCR中，需要花费大量的时间去优化反应，才能解决这个...