PCR的基本步骤及注意

DNA 聚合酶 （DNApolymerase I）最早于 1955 年发现，而较具有实验价值及有用性的 Klenow fragment of E. Coli 则是于 70 年代的初期由 Dr。 H。 Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应.现今所使用的酶（简称 Taq polymerase）, 则是于 1976 年从温泉中的细菌 （Thermusaquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于 80 年代之后。PCR 最初的原始雏形概念是类似基因 修复复制，它是于 1971 年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因 复制（类似 PCR前两个周期反应)的实验.而现今所进展出来的 PCR 则于 1983 由 Dr。 Kary B。 Mullis 进展出的，Dr. Mullis 当年服务于 PE 公司，因此 PE 公司在 PCR 界有着特别的地位.Dr. Mullis 并于 1985 年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它讨论方法难望其项背。随后 PCR 技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学讨论的最重要技术。Mullis 也因此获得了 1993 年诺贝尔 化学奖。PCR 原理 DNA 的半保留复制 是生物进化和传代的重要途径.双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋 成单链,在 DNA 聚合酶的参加下,根据碱基互补配对原则 复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物 ，DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制. 但是,DNA 聚合酶在高温时会失活，因此,每次循环都得加入新的 DNA 聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了 PCR 技术的应用和进展。 发现耐热 DNA 聚合酶-—Taq 酶对于 PCR 的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受 90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶,使 PCR 技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR 技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR 由变性——退火—-延伸三个基本反应步骤构成：①模板 DNA 的变性:模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它...