1、打开后的界面如图。2、点FILE---NEW —DNA SEQUENCE 如图3、输入目的基因片段，可以复制后用 ctrl+V 键拷贝到栏内，后应加数个 N 以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。输入目的基因片段，可以复制后用 ctrl+V 键拷贝到栏内，后应加数个 N 以备后续设计时加酶切位点及保护碱基，如图所示。4、此主题相关图片如下：选中 enzyme 图标，将所选质粒上的多克隆酶切位点加入左栏 此主题相关图片如下：选中 OK 键，5、分析目的基因中所含的酶切位点，选插入位点时就应排除这些酶 此主题相关图片如下：6、选中 primer 图标，点 S 图标，editprimer,开始设计正义链。此主题相关图片如下：7、软件默认引物为二五个碱基 此主题相关图片如下8、可将鼠标点在设计框的 3 端从右向左删除 7－9 个碱基，保留 16－18 个配对即可 此主题相关图片如下：9、在引物的 5 端加入选好的酶切位点并在其左侧加 3 个保护碱基，入该图加入 HIND III酶切位点及 TTA 保护碱基，完成后点 analyze，认为可以后点 OK。此主题相关图片如下：10、选中左上角 A 图标，用鼠标拉动滑块将待选引物放至目的基因末端。11、从 3 端删除 7－9 个碱基同正义链。此主题相关图片如下：12、将酶切位点加在 5 端，应将产品目录所示的酶切位点序列从右至左加入（注意不要加反）如图加入 BamH I 酶切位点及 CGC3 个保护碱基。完成后点 analyze，认为可以后点 OK。此主题相关图片如下：13、最后分析结果如图，反义链的 FALSE PRIMING 可以不考虑，RATING 表示引物评分也可以不考虑，主要看 Tm 值正义链和反义链相差不应超过 3 度。GC 含量不应超过 60％此主题相关图片如下：14、该软件有个缺点，不能保存分析结果，只能选择打印 此主题相关图片如下：15、如果设计RT-PCR 检测的引物就如下所示，同上输入目的基因片段，选SEARCH 图标，选择参数，一般选PCR primers---both—100至 250 个碱基，引物长短 20＋/-2，search parametere中的参数可以不选，为默认设置。点 OK。 此主题相关图片如下：16、显示满足设计参数的候选结果，点 OK.此主题相关图片如下：17、点 SENES 选择正义链，RATING 表示引物评分，最好选评分高的。此主题相关图片如下：18、点 ANTI-SENSE,相同方式选择反义链。整个一队引物评价同目的基因克隆的引物设计相同 此主题相关图片如下：
