竹 密 岂 妨 流 水 过 蛮 鬼 2018.3 山 高 哪 碍 野 云 飞 1/5( 稳 转 ) 稳 转 慢 病 毒 一 、 所 需 试 剂 1、 慢 病 毒 载 体 ( 详 细 信 息 见 附 录 及 《 质 粒 的 扩 增 提 取 》)( 大 肠 杆 菌 -80℃ 保 存 2-3 年 , 质 粒-20℃ 保 存 2-3 年 , 病 毒 液 -80℃ 保 存 1 年 ) ( 1) 载 体 质 粒 : 两 端 的LTR、 剪 切 位 点 、 包 装 信 号Ψ 以 及 抗 性 或 荧 光 基 因 、 gag 基 因5′端 350bp 的 序 列 及 位 于 env 序 列 中 的 RRE, 含 宿 主 RNA 聚 合 酶 识 别 部 分 ( 2) 包 装 质 粒 ( psPAX2): 包 含 了 pol、 gag 包 装 成 分 ( 3) 包 膜 质 粒 ( pMD2.G): 用 其 他 病 毒 的 包 膜 蛋 白 代 替 了 env 基 因 . 三 种 质 粒 共 同 转 染 产 生 不 具 有 自 我 复 制 能 力 的 病 毒 载 体 。 2、 包 装 细 胞 : 293T 细 胞 3、 菌 株 : 大 肠 杆 菌 , 用 于 提 取 质 粒 4、 转 染 试 剂 : XTREME-GENE( -20℃ 保 存 , 不 可 分 装 ), 一 种 脂 质 与 其 他 组 份 构 成 的 混 合 物 5、 浓 缩试 剂 ( 配好后4℃ 保 存 , 原材料室温保 存 ): 5X PEG8000/NaCl 溶液 ( 聚 乙二醇): NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200m l Milli-Q 纯水 中 , 高 压蒸汽灭菌 **也可 直接从公司买来病 毒 液 ( -80℃ 封口膜 封口冻存 管保 存 , 4℃ 保 存3 天): 滴度一 般为108TU/ml 6、 10mg/ml polybrene( -20℃ 分 装 保 存 ): 溴化己二甲铵。 是带正电的 小分 子, 与 细 胞 表面的 阴离子结合 , 提 高 慢 病 毒 对细 胞 的 感染 效率, 通常加入polybrene 能 提 高 感染 效率2~10 倍。 有 一 定细 胞 毒 性 , 需 要摸索浓 度( 1~10μg/ml) 7、 无血清培养基 : optimen 8、 贴壁细 胞 ( 复 苏后3 代 以 上的 细 胞 ) 9、 puromycin: 嘌呤霉素, 用 于 筛选稳 转 细 胞 二、 具 体 步骤 <一 >病 毒 包 装 与 收集( 中 皿, 转 染 步骤类似于 瞬转 ) 第一 ...