整理)慢病毒稳转细胞株步骤VIP免费

竹 密 岂 妨 流 水 过 蛮 鬼 2018.3 山 高 哪 碍 野 云 飞 1/5（ 稳 转 ） 稳 转 慢 病 毒 一 、 所 需 试 剂 1、 慢 病 毒 载 体 （ 详 细 信 息 见 附 录 及 《 质 粒 的 扩 增 提 取 》）（ 大 肠 杆 菌 -80℃ 保 存 2-3 年 ， 质 粒-20℃ 保 存 2-3 年 ， 病 毒 液 -80℃ 保 存 1 年 ） （ 1） 载 体 质 粒 ： 两 端 的LTR、 剪 切 位 点 、 包 装 信 号Ψ 以 及 抗 性 或 荧 光 基 因 、 gag 基 因5′端 350bp 的 序 列 及 位 于 env 序 列 中 的 RRE， 含 宿 主 RNA 聚 合 酶 识 别 部 分 （ 2） 包 装 质 粒 （ psPAX2）： 包 含 了 pol、 gag 包 装 成 分 （ 3） 包 膜 质 粒 （ pMD2.G）： 用 其 他 病 毒 的 包 膜 蛋 白 代 替 了 env 基 因 . 三 种 质 粒 共 同 转 染 产 生 不 具 有 自 我 复 制 能 力 的 病 毒 载 体 。 2、 包 装 细 胞 ： 293T 细 胞 3、 菌 株 ： 大 肠 杆 菌 ， 用 于 提 取 质 粒 4、 转 染 试 剂 ： XTREME-GENE（ -20℃ 保 存 ， 不 可 分 装 ）， 一 种 脂 质 与 其 他 组 份 构 成 的 混 合 物 5、 浓 缩试 剂 （ 配好后4℃ 保 存 ， 原材料室温保 存 ）： 5X PEG8000/NaCl 溶液 （ 聚 乙二醇）： NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200m l Milli-Q 纯水 中 ， 高 压蒸汽灭菌 **也可 直接从公司买来病 毒 液 （ -80℃ 封口膜 封口冻存 管保 存 ， 4℃ 保 存3 天）： 滴度一 般为108TU/ml 6、 10mg/ml polybrene（ -20℃ 分 装 保 存 ）： 溴化己二甲铵。 是带正电的 小分 子， 与 细 胞 表面的 阴离子结合 ， 提 高 慢 病 毒 对细 胞 的 感染 效率， 通常加入polybrene 能 提 高 感染 效率2～10 倍。 有 一 定细 胞 毒 性 ， 需 要摸索浓 度（ 1～10μg/ml） 7、 无血清培养基 ： optimen 8、 贴壁细 胞 （ 复 苏后3 代 以 上的 细 胞 ） 9、 puromycin： 嘌呤霉素， 用 于 筛选稳 转 细 胞 二、 具 体 步骤 <一 >病 毒 包 装 与 收集（ 中 皿， 转 染 步骤类似于 瞬转 ） 第一 ...