慢病毒载体构建演讲人：华仁武导师：雷明刚1.整体步骤1.质粒构建(1).超表达载体穿梭质粒(2).shRNA（1）.质粒构建步骤（以CD513B为例）引物设计PCR扩增、连接T载、转化挑菌、摇菌、送样检测、菌液扩增提质粒、双酶切、连接cd513b、转化挑菌、摇菌、PCR检测、菌液扩增，提质粒、双酶切验证第一天第二天第三天第四天第五、六天可选:等一天测序结果D1.引物设计（NCBI、Prime5）•添加酶切位点和保护碱基（推荐XbaI、NotI）需要确定自己的目的序列是否有相同酶切位点序列，有则不能用D2.PCR扩增、跑胶、胶回收、连接T载、转化D3.挑菌、摇菌、送样检测、菌液扩增每次两个重复，每板挑4-6个菌D4:提质粒、双酶切、连接cd513b、转化D5、6挑菌、摇菌、PCR检测、菌液扩增，提质粒、双酶切验证2.病毒包装前期准备•A目的载体：将目的基因片段连到慢病毒载体上，酶切，连接，转化，抽质粒，测序•B包装质粒：三个质粒按照以下比例混合PMDLG：PMDG:PRSV(2:1:1),混成终浓度为1mg/ml（至少要达到0.75mg/ml）•C293t细胞：细胞状态要好，直接影响到病毒的效率，传的代数不要太多•D试剂：慢病毒转染试剂（我们用的是fugene6），polybrene(病毒感染用),opti24H48H3.慢病毒收集和浓缩并感染目的细胞4.筛选稳定表达的细胞株注意事项谢谢大家学到了就要教人，赚到了就要给人
