1 qPCR 引物设计原则及具体操作步骤 1 . 找基因（DNA） 1 ) 通过英文名称查找 通过查看文献或者百度搜索查找到对应基因的准确的英文名称 →进入NCBI 官网 →点击网页右下角GenBank，进入GenBank 界面 →在搜索框中输入准确的英文名称，点击Search 搜索即可 2 ) 通过序列号查找 通过查找文献，找到相应基因在GenBank 上的登录号，直接输入上面的搜索框进行查找即可。 例如：犬冠状病毒(canine coronavirus，CCV)基因保守片段序列号为KT222978。 3 ) 通过引物查找 通过查找文献，找到别人用过的对应的引物 →在NCBI 官网右下角点击Primer-BLAST →输入正、反向引物序列 →设置对应参数 →点击“Get Primers”进行搜索即可 4 ) 找到对应的基因后点击“FASTA”，进入相应界面，再点击“Send to”选择相应格式，保存序列。 2 2 . qPCR 引物和TaqMan 探针的设计 1) 引物设计注意事项 a) 引物长度17bp-25bp 为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性 b) 扩增片段长度为：90-150 bp（最低不能超过70，最高不能超过180） c) 引物的Tm 值为：最小57℃，最大63℃，最适为60℃，两条引物之间退火温度得差距不超过1℃，推荐使用 Primer Premier 5 进行Tm 值计算； d) 引物A、G、C、T 整体分布尽量要均匀，避免使用GC 或者TA 含量高的区域，尤其是 3’端，必须避开 GC 含量不均匀的区域。 e) 引物设计时请尽量避开 TC 或者AG 的连续结构。 f) 3’端不能超过3 个以上碱基互补，自互补碱基数不超过3；3’端最后一个碱基绝对不能搭上 g) 特异性要有保证，与非特异模板 3’端互搭碱基数不超过3，不连续出现4 个及以上的GC 互搭 h) 引物3’端最后五个碱基不能包含超过2 个以上的G 或者C i) 引物的GC 含量控制在 40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间 j) 正向或者反向引物应尽量接近探针序列但是不能和探针序列有重合区域 k) 在 Primer-BLAST 设计时，在 Organism 处选择相应物种 l) 需跨外显子设计，避免基因组污染 2) TaqMan 探针设计指南 a) 探针序列应尽量接近正向或者反向引物，但是不能与之有重合区域；一般相隔 1~5 个碱基（一般 10 个以内，最好是 1 个碱基）。 b) 应避免连续相同的碱基出现，特别是要避免 GGGG 或者更多的连续 G 出现。 c) 探针5’端应避免使...
