RNA干扰步骤VIP免费

一、磷酸钙转染法 【实 验 原 理】 磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA 复合物的一种将 DNA 导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源 DNA 与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA 复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的 DNA 可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器、用具 CO2 培养箱、10cm 细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml 锥形管、烧杯、量筒等。 （二）材料 呈指数生长的真核细胞 BALB/c 3T3 CsCl 纯化的表达质粒 DNA （三）试剂 1．完全培养液 DMEM 90ml FCS 10ml 2．2M CaCl2，过滤除菌，-20℃保存备用 3．2× HEBS (g/500ml) NaCl 8.0 KCl 0.38 Na2HPO4.7H2O 0.19 HEPES 5.0 葡萄糖 1.0 用NaOH 调pH 至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。 【方法与步骤】 1．在 10cm 的培养板上接种 1× 106 个 BALB/c 3T3 细胞 第二天进行转染 2．准备 CaPO4 沉淀 2.1 准备两组试管 在 A 管中加入： 15μg 质粒 DNA 69μl 2M CaCl2 460μl 重蒸水 在 B 管中加入： 550μl 2×HEBS 2.2 用巴斯德吸管将 A 管中的溶液缓慢地逐滴加入在 B 管中，同时用另一吸管吹打 B 管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续 1～2min。 2.3 室温静置 30min，出现细小颗粒沉淀。 3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的 10cm 平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。 4. 在 5%CO2 的加湿培养箱中培养细胞 2-6 hr。 5. 除去培养液，加入 10ml 完全培养液培养细胞 1-6 天（依具体情况而定）。 6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。 【注 意 事 项】 1．在整个转染过程中要保持无菌操作。 2．在实验中使用的各种试剂都必须小心校准，保证质量。 3．质粒 DNA 需 CsCl 纯化，乙醇沉淀后的 DNA 应保持无菌，在无菌水或 Tris- EDTA 中溶解。 4．沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入 DNA-CaCl2 溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的 DNA 不能有效地黏附和进入细胞。 二、电穿孔和电融合技术 [实验原理] 当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，...