分子生物学实用技术（S219）实验操作教程 西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员 1 实验一 CTAB法提取植物基因组总DNA及分析 一、实验目的 分离纯化植物 DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求，CTAB法是提取植物基因组 DNA的一种新型方法，可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料（如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等）中的 DNA，得率高，质量好，用于 PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。 二、基本原理 植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止 DNA降解。采用 CTAB（十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65℃）上述研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且 CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质（沉淀相）去除，水相中含有核酸与 CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。粗提的 DNA一般可用于粗略PCR等。 用于精细 PCR、Southern杂交和 DNA文库构建的 DNA则应进一步纯化。用 RNase水解 RNA，用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。 三、实验材料 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)幼叶。 四、主要仪器设备及耗材 Eppendorf 5804R低温离心机，Hettich Universal 32R低温离心机，Eppendorf Minispin离心机，Sanyo SIM-F124制冰机，TOMY SS-325自动灭菌锅，Millipore Elix纯水系统，Eppendorf research微量移液器系列，GingTian JA2003A电子天平，Satorius PB-10 pH计，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVP GDS8000自动高效紫外透视成像仪，DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，Gene spec I快速核酸蛋白自动分析仪，长岭 BCD-239家用冰箱，TNZ-30-50液氮生物容器及液氮，微波炉，研钵，离心管（15ml、1.5ml），枪头（10、200和 1000μ l），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。 五、主要试剂 1、CTAB抽提液： 2%（w/v）CTAB 100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） 20mmol/L EDTA（pH=8.0） 1.4mol/L NaCl 最后 pH值 8.0。 抽提含多酚较多的植物材料时，上述抽提液中可另加入2%的 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。 抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。临用之前向...
