引物合成和NGS构建VIP免费

MakeResearchEasyCONFIDENTIAL测序技术概述NGS基本流程NGS技术平台及文库构建引物介绍NGS应用及市场预期目录MakeResearchEasyCONFIDENTIAL第一代测序技术第三代测序技术测序技术发展第二代测序技术金标准，读长长，超级贵关键词于1975年，由Sanger等人开创，主要原理：核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。通量大，准确率高，成本低原理原理关键词通过核酸片段化构建文库，进行扩增以后在载体上进行变合成变测序反应，扩大至百万级的平行反应，完成对海量数据的高通量检测。以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生。原理关键词以单分子为目标的边合成边测序，不需要通过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。价格贵，准确率低，读超长MakeResearchEasyCONFIDENTIAL测序仪器及成本发展MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS基本流程样品提取文库构建测序数据分析DNA或者RNA样品多重PCR探针捕获IlluminaThermo赛默飞数据分析解析MakeResearchEasyCONFIDENTIAL相关专业名词及解释在Illumina测序平台中会采用桥式PCR方式生产DNA簇，每个DNA簇才能产生亮度达到CCD可以分辨的荧光点。Flowcell:测序芯片Cluster:簇在Illumina平台的多重测序（MultiplexedSequencing）过程中会使用Index来区分样品，并在常规测序完成后，针对Index部分额外进行7个循环的测序，通过Index的识别，可以在1条Lane中区分12种不同的样品。Index:标签Barcode:条形码Barcode与Index同义，多指在RocheGSFLX454测序平台的16SPCR产物的测序过程中接头序列所包含的的用来区分不同样本的序列。MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS主要技术平台及原理——Illumina桥式PCR4色荧光可逆终止激光扫描成像文库制备桥式PCR扩增与变性——放大信号测序——测序碱基转化为光学信号测量准确，成本低读长短后续拼装比较费时费力通量较大不适合单个样品测序原理主要步骤优劣势MakeResearchEasyCONFIDENTIALIllumina基于桥式PCR的测序流程MakeResearchEasyCONFIDENTIAL桥式PCR流程图解MakeResearchEasyCONFIDENTIALSBS测序方式及原理MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS主要技术平台及原理——ThermoFisher油包水PCR4种dNTP车轮大战微电极PH检测文库制备乳液PCR——注水入油独立PCR微电极pH检测——磁珠入池记录pH成本低灵敏度高耗时少通量较低测序原理主要步骤优劣势MakeResearchEasyCONFIDENTIALIonTorrent的测序流程——ThermoFisherMakeResearchEasyCONFIDENTIAL65%20%15%illuminaThermo其它科研医学/健康其它（司法、环境，新药等）0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%测序平台比较芯片Thermoilumina一代测序IlluminaIllumina和Thermo测序平台对比MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS引物类别MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS文库构建（WGS）及引物需求测序类型：人重测序，动植物、微生物的denovo和重测序，16srRNA测序，宏基因组测序主要应用客户：科研院所，少数公司（华大等）片段化DNA末端补平3’加A接头连接PCRP5:5‘-AATGATACGGCGACCACCGA-3‘P7:5‘-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3‘Index:6-8basesequencetomakerdifferentsamplesRd1andRd2:specificinlibrarypreparationkits(~32bp)接头引物Indexadaptoroligo扩增引物AmplificationoligoMakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS文库构建（探针捕获）及引物需求——Illumina测序平台测序类型：全外显子，特定目标区域主要应用客户：分子诊断试剂盒研发公司（疾病诊断，产前检查等）样品片段化两段添加Adaptor与特定的探针引物进行杂交将目标片段洗脱下来进行扩增上机测序BlockingoligoCaptureprobes5′端生物素标记60-120碱基长度MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS文库构建（多重PCR）及引物需求——Illumina和Thermo测序平台测序类型：特定目标基因panel测序主要应用客户：分子诊断试剂盒研发公司（疾病诊断，产前检查等）样品提取多重PCR富集所需片段降解PCR引物序列片段末端添加Adaptor上机测序多重PCR引物上千条引物混合在一起均一性要求高覆盖率需要大于99%MakeResearchEasyCONFIDENTIALNGS应用及市场预期基础科学研究疾病诊断农业育种健康体检司法鉴定环境监测药物研发辅助生殖其它MakeResearchEasyCONFIDENTIALTargetEnrichmentandAmplificationIndustryTargetenrichmentandamplificationisanimportantpartoftheNGSsamplepreparationprocess,asitallowsformoreefficientlibraryconstructionandsubsequentmolecularanalysis.