1 《基因工程》实验报告 一、实验目的 1.学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒 DNA 的提取方法。 2.学习琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理和方法，检测质粒 DNA 的浓度与分子量。 3.了解 PCR 的基本原理，掌握 PCR 的基本操作技术。 4.学习利用限制性内切酶切割 DNA 的方法，并通过电泳检测酶切的效果。 5.学习 DNA 重组技术中的核心步骤，DNA 片段之间的体外连接方法。 6.学习制备感受态细胞并将体外重组 DNA 引入受体细胞的技术。 7.掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。 二、实验原理 （1）质粒 DNA 的小量制备 在碱性溶液中，双链 DNA 氢键断裂，DNA 双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒 DNA 分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性 pH 条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒 DNA 又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体 DNA 则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS 等形成不溶性复合物。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体 DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒 DNA 及小分子量的 RNA 则留在上清液中。混杂的 RNA 可用 RNA 酶(RNaseA)消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。 （2）琼脂糖凝胶电泳与凝胶中 DNA 的检测 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同 DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 SYBR GoLd 是一种极敏感的染料。其可与 DNA 分子形成SYBR GoLd -DNA复合物，在紫外光照射下发射荧光，且荧光强度与 DNA 的含量成正比。用肉眼观察，可检测到20pg 以上的 DNA。 （3）PCR 扩增功能基因 2 PCR(聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性：目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3) 延伸：DNA模板—引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应原料，目的基因序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA ...
