基因表达的半定量PCR检测VIP免费

基因表达的半定量PCR 检测 实验目的： 以cDNA 为模板，利用PCR 技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR 引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。 实验原理： 真核细胞含有三类基本RNA：核糖体RNA（rRNA）、信使 RNA（mRNA）、转移 RNA（tRNA）。其中mRNA 传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。Trizol 试剂可从细胞中快速提取细胞总 RNA，将其中的mRNA 逆转录成 cDNA，以一对特异性引物对目的cDNA 进行聚合酶链式反应扩增。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA 的拷贝数呈几何级数增长，因此，30 次 PCR 循环将产生约 1 亿倍（230）的扩增片段。 PCR 技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然 DNA 的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4 种 dNTP 和耐热 DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA 区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环 30 次，介于两个引物之间的新生 DNA 片段理论上达到 230 拷贝（约为109 个分子）。PCR 技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图 3-1）。PCR 反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing ）；中温延伸（extension）三步反应（图 3-2）。 ①变性（denaturation）（95℃）；②退火(annealing)；③延伸(elogation)（72℃） 图 3-1 PCR 扩增 DNA 原理示意图 图 3-2 PCR 实验中各种组分的剂量： （1）dNTP 常用浓度为 20~200μM，不能低于 10~15μM。 （2）引物浓度一般在 0.1~1.0μM。 （3）Mg2+ 浓度范围通常为 0.5~2mM。（3）在 100μl PCR 反应中，1.5~2U 的 Taq DNA 聚合酶就足以进行 30 轮循环。 （4）一般反应中的模板数量为 102~105 个拷贝，对于单拷贝基因，这需要 0.1μg 的人基因组 DNA，10ng的酵母 DNA，1ng 的大肠杆菌 DNA；扩增多拷贝序列时，用量更少。 （5）反应缓冲液：反应缓冲液一般含 10~50mM Tris-HCl (20℃下 pH8.3-8.8)，50mM KCl 和适当浓度的Mg2+。Tris-HCl 在...