QPCR实验技术VIP专享VIP免费

实时荧光定量PCRContent1简介2实验原理4总结3实验步骤Part.1简介实验原理几个PCR概念：PCR：一般指普通PCR，结果主要通过DNA电泳来实现RT-PCR：reversetranscription-PCR，指将mRNA变成cDNA,没有结果Q-PCR：定量PCR，一般是用我们想要的基因与管家基因比值形式呈现Real-timePCR：就是Q-PCR，有时候也写成RT-PCR，要与逆转录PCR区分简介实时荧光定量PCR技术(real2timefluorescencequantitativePCR,RTFQPCR)，是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新技术，具有高度的灵敏性、特异性和精确性。TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现和荧光双标记探针的运用推进了Q-PCR。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。简介它是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量。在扩增的指数增长期就测量扩增产物，因为扩增指数增长期测量值与特异DNA（RNA）起始量存在相关性，从而实现定量检测。Q-PCR的仪器由实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件几部分组成。Part.2实验原理实验原理定量原理:实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团,使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系,从而得出产物的扩增曲线。实时荧光定量PCR的标准扩增曲线实验原理起始浓度：高中低CT值：达到标准荧光浓度所需要的循环数。越小意味着达到标准浓度所需要的循环数越少，该模板的copy数就越多。即起始拷贝数越多，Ct值越小。实验原理实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测SYBRGreenI和水解探针检测TaqMan探针。实验原理SYBRGreenITaqMan方便方便应用广泛SYBR效果差的基本都可以解决特异性差特异性强主要用于常见与高表达基因主要应用于不常见与低表达基因Part.3实验步骤实验步骤1样品准备2点样4数据分析3上机实验步骤——样品准备RNA提取实验步骤——样品准备RNA提取：1.RNA分离加入1mlTRIzol试剂（在培养板中加入TRizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml），重悬细胞，室温孵育5min→加入0.2ml氯仿（1mlTRIzol加0.2ml氯仿）→室温孵育10min→4°C，12000g(RCF)离心15min→收集上层无色水相于EP管中2.RNA沉淀加入0.5ml异丙醇（一般加入1mlTRIzol要加入0.5~0.6ml异丙醇或者与水相等体积）→震荡均匀，室温孵育5~10min→4C°，12000g离心10min，弃去上清液3.RNA洗脱加入1ml75%乙醇→4C°，12000g离心5min，弃去上清液4.RNA再溶解空气干燥10min→加入20~40ulDEPC水溶解5.RNA保存-80C°保存或者立即逆转录实验步骤——样品准备逆转录：20ul体系：试剂14ul+试剂31ul+试剂41ul+最后加入试剂21ul配成一个体系→前面算出的RNA体积+13-前面的体积是加入的试剂5的体积→两个混合，上机逆转录→-20C°保存。Components体积备注5×primescriptbuffer4ul试剂1primescriptRTenzymemix1ul试剂2试剂2最后加入oligodTprimer(50nm×1)1ul试剂3random6:mers(100nm×1)1ul试剂4trizolRNAXulRnasefreeH2O13-Xul试剂5实验步骤——样品准备Q-PCR：逆转录结束后，将引物、SYGreen、DEPC放于冰盒中。配置体系：SYGreen5ulE1(引物R)0.3ulE2(引物F)0.3ul模板0.6ulDEPC水3.8ul保证引物终浓度是0.1-0.5uM.体系1体系2实验步骤——点样GAPDH-ConGeneA-ConGAPDH-ConGeneA-ConGAPDH-ConGeneA-ConGAPDH-ConGeneA-ConGAPDH-si-AGeneA-si-AGAPDH-si-AGeneA-si-AGAPDH-si-AGeneA-si-AGAPDH-si-AGeneA-si-A实验步骤——点样实验步骤——上机上机程序实验步骤——数据分析增长曲线融解曲线实验步骤——数据分析结果作图Part.4总结总结Q-PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。谢谢观看Thankyou