1肠道杆菌的分离鉴定肠道杆菌的分离鉴定IsolationandIdentificationofEnterobacteria肠道杆菌分离鉴定程序简介粪便标本接种可疑菌落形态学检查接种可疑菌落至双塘培养基抗生素敏感性试验，IMViC试验肠道血清学鉴定一、肠道杆菌分离鉴定程序简介标本采集初步鉴定脓血便直接涂片镜检接种显色培养基接种选择培养基增菌进一步鉴定药敏试验接种双糖和尿素培养基（CB平板、SS平板、EMB平板）粪便标本肠道致病菌鉴别流程标本鉴别培养基（SS培养基）生化反应（双糖管）血清学鉴定SS平板挑取可疑菌落2个(无色,透明,小菌落)接种双糖管培养,观察二、粪便标本接种PNNametime小辫法分区划线法①②③④注意：每划完一个区进行下一区之前取菌环要灭菌标本SS培养基粪便标本接种：标本：1）病人粪便（阳性标本）；2）正常人粪便（阴性）培养基：SS平板操作：将SS平板上分两个区，分别接种病人和正常人标本。要求：使用正确的画线方法，必须培养出单个菌落以备后续实验使用；两种标本不可跨区接种。病人标本正常人标本划线方法要求形成的菌落形态三、可疑菌落的形态学检查粪便标本接种结果观察：病原菌:菌落较小,无色（淡黄色）,透明（半透明）非致病菌:菌落较大,红色四、双糖试验（接种可疑菌落至双糖培养基）实验目的：通过双糖实验了解肠杆菌科的初步建立方法。实验原理：双糖培养基分上下两层。上层为固体含有铁和乳糖，下层含有葡萄糖的半固体培养基，上下层均含酚红指示剂。接种细菌后通过以下几点鉴别细菌：1）是否分解乳糖和葡萄糖：糖分解后产酸使酚红变黄，或糖分解产酸产气使酚红既变黄又见气体（可使培养基断裂后出现气泡）产生；2）是否产生H2S：如果产生H2S，能与铁生成黑色沉底；3）是否有动力：在半固体中有动力的细菌，可使穿刺接种线模糊，无动力的细菌，穿刺接种线保持清晰。双糖-铁培养基LactoseAgar1.5%Sodiumthiosulfate(硫代硫酸钠，产生H2S源)Ferroussulfate(硫酸亚铁，产生H2S指示剂)Phenolred(酚红，pH指示剂)GlucosePhenolredAgar0.3%实验材料（菌种）：可疑单个菌落；实验步骤：用接种针取可疑菌落（上节课SS培养基中生长的单个菌落）接种至双糖培养基。穿刺接种法接种：接种针从培养基中心刺入双糖培养基下层约占下层2/3处，将针原处返回，提至斜面再换线。实验结果：37℃培养18-24h后观察结果。双糖-铁试验结果及尿素利用实验结果项目大肠埃希氏菌伤寒沙门氏菌甲型副伤寒沙门氏菌乙型副伤寒沙门氏菌痢疾志贺氏菌变形杆菌乳糖利用⊕-----葡萄糖利用⊕+⊕⊕+⊕动力++++-+H2S产生-+/-+/-++++-++尿素利用-----+UreaUreaAmmoniaAmmoniaPhenolredPhenolredRedRedcolorcolor五、IMViC试验②Methylredtest（甲基红实验）蛋白胨①IndolTest（吲哚试验）色氨酸酶吲哚寇氏试剂玫瑰吲哚④Citrateutilizationtest（枸橼酸盐利用实验）葡萄糖分解丙酮酸甲酸、乙酸等，pH下降，甲基红变红③Vogea-Proskauertest（V-Ptest）葡萄糖分解丙酮酸分解丙酮酸分解脱羧乙酰甲基甲醇碱二乙酰胍基红色化合物（对二甲基氨基苯甲醛）枸橼酸磷酸二氢氨产气肠杆菌代谢碱溴麝香草酚兰深蓝色绿色IMViC试验：四种生化反应试验的统称。吲哚试验甲基红试验鉴别大肠埃希氏菌V-P试验和产气肠杆菌枸橼酸盐利用试验E.coliE.a注意：①拿试管时不要只拿盖子②避免交叉污染蛋白胨水（蓝色盖）E.coli葡磷胨水（绿色盖）E.coli葡磷胨水（绿色盖）E.coli枸橼酸盐水（红色盖）磷酸二氢氨E.coli蛋白胨水（蓝色盖）E.a葡磷胨水（绿色盖）E.a葡磷胨水（绿色盖）E.a枸橼酸盐水（红色盖）磷酸二氢氨E.a大肠杆菌（++--）产气杆菌（--++）IMVCIMViC实验结果•吲哚试验：滴加寇氏试剂2-3滴，静置观察。•甲基红试验：滴加甲基红试剂2-3滴，轻轻摇动观察结果。•V-P试验：加6%a-萘酚0.6ml，混匀后再滴加40%KOH0.2ml，充分振摇5-10min，静置一段时间，观察结果。•枸橼酸盐利用试验：阳性由绿色变为蓝色。六、抗生素敏感性试验—纸片扩散法Antibioticsusceptibilitytest-diskdiffusiontest•Mainpurposes:Mainpurposes:–AsaguidefortreatmentAsaguidefortreatment–AsanepidemiologicaltoolAsanepidemiologicaltool...
